3Brain高分辨3D電極在腦類器官、神經(jīng)小球電生理記錄中的應(yīng)用

如今，有多種源自人類和動(dòng)物的3D模型，如組織切片、球體、類器官等，能夠以更高的準(zhǔn)確性和相關(guān)性重現(xiàn)大腦結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵特征，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)。然而，這些3D系統(tǒng)的復(fù)雜性不斷增加，帶來了新的方法學(xué)挑戰(zhàn)。從生理學(xué)角度來看，一個(gè)關(guān)鍵問題是能否以足夠的時(shí)空分辨率探測這些相互連接的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而在對(duì)生物系統(tǒng)造成最小干擾的情況下準(zhǔn)確描述其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)。

最有前景的方法之一是微電極陣列（MEA），這是一種細(xì)胞電子生物接口技術(shù)，廣泛用于在體外和離體條件下對(duì)神經(jīng)樣本進(jìn)行非侵入、無標(biāo)記及多位點(diǎn)的電生理記錄。除了用于原代細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的2D細(xì)胞培養(yǎng)物外，這些設(shè)備還用于結(jié)構(gòu)化的3D模型，如急性腦片、腦類器官和神經(jīng)小球等3D培養(yǎng)模型。然而，在3D模型中使用這種技術(shù)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一些關(guān)鍵的局限性(圖1)：第一個(gè)主要的問題在于，傳統(tǒng)的MEA大多數(shù)都是平面的，這導(dǎo)致所記錄的信號(hào)主要來自最外層。腦片由于制備中的震蕩切片過程，導(dǎo)致其表面神經(jīng)存活性較差；而對(duì)于腦類器官，研究者無法通過平面電極探尋其內(nèi)部的電活動(dòng)或者是復(fù)雜的神經(jīng)震蕩。

第二個(gè)局限性是，由于3D樣本具備立體結(jié)構(gòu)的特殊性，傳統(tǒng)的MEA不具備足夠的采樣電極數(shù)量，去精確捕獲其復(fù)雜而精細(xì)的電活動(dòng)。3Brain基于CMOS技術(shù)設(shè)計(jì)的高分辨MEA（HD-MEAs），能夠在一塊芯片上集成數(shù)千個(gè)電極，從而具備了細(xì)胞或亞細(xì)胞的空間分辨率，以高時(shí)空分辨率的視角，使復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電動(dòng)的一覽無余。

第三個(gè)問題是應(yīng)對(duì)3D模型中細(xì)胞緊密的排列，這需要高效的營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散、適當(dāng)?shù)难鯕夤��?yīng)以及快速清除代謝廢物，以避免組織核心迅速壞死。傳統(tǒng)的或平面高分辨微電極陣列（HD-MEA）設(shè)備需要細(xì)胞與電極緊密接觸才能獲取信號(hào)，這意味著組織必須很好地貼附在平面電極上，這一局限性極大的影響了樣本的活性以及快速給藥實(shí)驗(yàn)。3Brain的3D電極設(shè)計(jì)集成了微流控通道從根本上改善了這些問題，實(shí)現(xiàn)長時(shí)間維持樣本活性，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。

圖1 2D及3D HD-MEA的對(duì)比

在本文中，研究者利用新穎的3D高分辨微電極陣列（3D HD-MEA）技術(shù)，對(duì)包括急性腦片、腦類器官和神經(jīng)小球在內(nèi)的3D生物樣本進(jìn)行了電生理記錄。首先，研究者展示了電極穿透組織的能力以及微流控通道在提高組織存活率方面的有效性。然后，研究者評(píng)估了3D HD-MEA在檢測自發(fā)和化學(xué)調(diào)節(jié)活動(dòng)以及誘發(fā)神經(jīng)活動(dòng)方面的有效性�？偠�言之，3D HD-MEA在3D模型中對(duì)神經(jīng)環(huán)路特性的生理學(xué)研究展現(xiàn)出了巨大潛力。接下來，小編慢慢帶您了解3D電極的方方面面。

在芯片上，研究者實(shí)現(xiàn)了兩種規(guī)格的3D電極：一種較粗，寬 26um，高 90 um（圖 2A）；另一種較細(xì)，寬 14um，高 65 um（圖 2B）。電極根部由聚對(duì)二甲苯包裹絕緣，僅在針尖處留有可進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)的界面（圖 2C）。

圖 2. 3D分辨微電極陣列芯片的特性及組織穿透情況。A、B）具有較大（a）或較�。╞）電極的 3D高分辨微電極陣列的SEM顯微圖像。箭頭指示微流控通道。C）單個(gè)3D電極的放大視圖。D）固定在 3D高分辨微電極陣列上的 250 um厚的小腦切片的SEM顯微圖像。用聚焦離子束進(jìn)行縱向切割，顯示電極穿透組織而未發(fā)生彎曲或變形。E）相位對(duì)比圖像顯示了放置在3D 高分辨微電極陣列上的腦類器官球體，其中組織與電極的緊密接觸狀態(tài)清晰可見。請(qǐng)注意，圖像聚焦在電極尖端所在的平面。F）數(shù)字顯微圖像（100x），展示了置于3D 高分辨微電極陣列上的皮層腦類器官。G、H）腦切片（G）和腦球體（H）的雙光子顯微鏡體積掃描圖像，用鬼筆環(huán)肽（綠色）和碘化丙啶（紅色）染色，芯片的自發(fā)熒光呈藍(lán)色�？梢杂^察到3D電極對(duì)組織的穿透情況。

為了測試3D高分辨微電極陣列（HD-MEA）的微流控通道是否能提高組織的存活率，研究者對(duì)三種不同的配置進(jìn)行了活力和功能測試。在連續(xù)灌注含氧的克氏液一小時(shí)后，將切片從芯片或蓋玻片上輕輕取出，并用 20 µM 的鈣黃綠素AM進(jìn)行染色，這是一種在活細(xì)胞中被酯酶水解后會(huì)發(fā)出熒光的化合物。從每片切片的兩側(cè)獲取共聚焦顯微鏡圖像，從而對(duì)鈣黃綠素染色進(jìn)行定量（圖 3A）。

將切片下側(cè)（與芯片或蓋玻片接觸的一側(cè)）的活細(xì)胞數(shù)量與上側(cè)（自由表面）的活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了比較。與上側(cè)相比，放置在蓋玻片上的切片下側(cè)的活力為 38 ± 4%，而放置在 LMC 3D HD- MEA 芯片上的切片下側(cè)的活力為 76 ± 3%（圖 3A）。這種差異與下側(cè)的接觸面積相符，3D 芯片上的接觸面積為3.6 mm2，而平面芯片上的接觸面積為 15mm2（圖 3B）。這些結(jié)果表明，微流控通道能夠提高組織活力，可能是因?yàn)楦纳屏饲衅�下層的營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散和氧氣的交換。

圖3. 平面和3D高分辨微電極陣列（HD-MEA）上小腦切片的組織活力和神經(jīng)活性。A）直方圖顯示了在平面（2D）或 3D HD-MEA 芯片上放置 1 小時(shí)后，小腦切片下表面（與芯片接觸）與上表面（與培養(yǎng)基接觸）的活力對(duì)比。下方展示了在 40 倍放大下，用鈣黃綠素 AM 負(fù)載的小腦切片在 LMC、IMC、SMC 和 2D 上的代表性共聚焦圖像�；罴�(xì)胞呈綠色；細(xì)胞核呈藍(lán)色（DAPI）。比例尺 = 20 um。注意 3D HD-MEA 芯片上活細(xì)胞的百分比更高。B）該圖展示了 A 中 每種配置下下表面與上表面活力的百分比對(duì)比。SMC、IMC 和 LMC 的接觸面積根據(jù)微通道寬度估算得出。C）用 VSDi 記錄獲得的偽彩色圖示例，展示了對(duì)照組（左）和 3D HD-MEA 上的切片（右）對(duì)苔蘚纖維刺激的顆粒層反應(yīng)的空間分布。刺激電極（黑色）位于苔蘚纖維束（MF）上方。GL，顆粒層。PCL，浦 肯野細(xì)胞層。ML，分子層。D）直方圖顯示了在 VSDi 實(shí)驗(yàn)中對(duì)苔蘚纖維刺激有反應(yīng)的顆粒層面積的百分比。所測試的兩種條件下的面積無顯著差異（數(shù)據(jù)以平均值±均方誤差的形式報(bào)告。如文中所述，LMC、IMC、SMC 分別代表具有大、中、小微流控通道的3D高分辨微電極陣列芯片，而 CTRL 表示將組織置于載玻片上。

在急性腦片中檢測3D電極對(duì)Spike活動(dòng)的記錄能力
采用小腦和皮層海馬切片來表征高分辨微電極陣列（HD-MEA）芯片上神經(jīng)的自發(fā)活動(dòng)。首先將切片放置在平面2D HD-MEA芯片上，然后轉(zhuǎn)移到3D HD-MEA 芯片上（反之亦然），每次記錄 3 分鐘。與平面HD-MEA芯片相比，3D HD-MEA芯片在檢測小腦浦肯野細(xì)胞層的活動(dòng)方面表現(xiàn)更優(yōu)，如圖4A中的放電率圖所示。使用 3D HD-MEA記錄的浦肯野細(xì)胞層的電活動(dòng)熱圖與小腦切片的解剖結(jié)構(gòu)匹配度更高，且細(xì)節(jié)更豐富（圖 4A）。

在小腦切片中，與平面 HD-MEA 芯片相比，在 3D 芯片上進(jìn)行的記錄顯示出更多的活躍電極（80 ± 19%，2D 上為 390 ± 49 個(gè)，3D 上為 790 ± 62 個(gè)；n = 6 個(gè)切片，p = 0.0006）、更多的神經(jīng)元個(gè)體放電信號(hào)（102 ± 23%，2D 上為 371 ± 45 個(gè)，3D 上為 668 ± 39 個(gè)；n = 6 個(gè)切片，p = 0.0005）以及更高的細(xì)胞與電極比例（12 ± 5%，2D 上為 1.05 ± 0.01，3D 上為1.18 ± 0.03；n = 6 個(gè)切片，p = 0.0126）（圖 4B）。此外，在進(jìn)行Spike檢測和分類后，與使用平面高分辨微電極陣列記錄的結(jié)果相比，3D芯片上的小腦切片中的活躍電極顯示出顯著更高的平均放電率（105 ± 30%；2D上為 25 ± 1.8 Hz，3D 上為 51 ± 5.4 Hz；p = 0.0010），同時(shí)峰峰值幅度也有顯著提高（46 ± 14%；2D 上為 76 ± 5 uV，3D 上為 111 ± 9 uV；p = 0.0060）（圖 4C）。

圖4. 3D高分辨微電極陣列（HD-MEA）與平面2D HD-MEA 在小腦切片中的記錄能力比較。A）小腦切片圖像，疊加了由 HD-MEA 電極檢測到的平均放電率的相應(yīng)電活動(dòng)圖（顏色刻度條：0 - 10 次/秒；平均放電率 > 0.5 次/秒）。左：切片置于平面 HD-MEA 芯片上；右：切片置于 3D HD-MEA 芯片上。插圖展示了平面和 3D HD-MEA 芯片的掃描電子顯微鏡圖像。B）直方圖顯示了平面和 3D HD-MEA 芯片上記錄到至少一個(gè)細(xì)胞外單位的電極數(shù)量、記錄到的細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞/電極比率。C）直方圖顯示了平面和 3D HD-MEA 芯片記錄到的單位的平均放電率和峰峰值幅度。在 B 和 C 中，直方圖報(bào)告了平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，星號(hào)表示顯著差異，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

同樣，使用3D分辨微電極陣列（HD-MEA）檢測到的皮層-海馬切片中的神經(jīng)元放電活動(dòng)比平面HD-MEA 更為明顯（圖5A）。與平面HD-MEA 相比，3D HD-MEA 在皮層區(qū)域顯示出更多的活躍電極（92 ± 85%，2D 上為56 ± 17 個(gè)，3D 上為154 ± 25 個(gè)；n = 3 個(gè)切片，p = 0.0384）（圖5C）。盡管增加數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但放置在3D HD-MEA 上的切片中的細(xì)胞數(shù)量（圖5B、C）和檢測到的放電次數(shù)（圖5C）均高于平面HD-MEA 芯片上的切片。值得注意的是，3D HD-MEA 檢測到的Spike峰峰值幅度顯著大于平面2D電極（105% ± 30%，2D 上為166 ± 7，3D 上為257 ± 30；n = 3 個(gè)切片，p = 0.0221）（圖5C）。

鑒于皮層活動(dòng)具有“隨機(jī)”且稀疏的放電模式，電極可能能夠觸及內(nèi)層，那里的神經(jīng)元保存得更好，從而增加了可檢測到的活躍電極的數(shù)量。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明，3D 高分辨微電極陣列（HD-MEA）的電極顯著提高了所測試腦區(qū)電極的記錄能力。

圖 5. 3D高分辨微電極陣列（HD-MEA）相對(duì)于平面 HD-MEA 在皮層-海馬切片中的記錄能力。A）皮層-海馬切片的圖像，疊加了由 HD-MEA 電極在 3 分鐘內(nèi)檢測到的相應(yīng)電活動(dòng)圖（顏色刻度條：0 - 50 個(gè)Spike）。上：切片放置在平面 HD-MEA 芯片上；下：切片放置在 3D HD-MEA 芯片上。B）平面和 3D HD-MEA 芯片中按細(xì)胞計(jì)數(shù)分布的Spike數(shù)量。C）直方圖顯示平面和 3D HD-MEA 芯片記錄的平均活躍電極數(shù)量、平均活躍細(xì)胞數(shù)量、平均總Spike數(shù)量以及Spike的峰峰值幅度。在 B 和 C 中，直方圖報(bào)告平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，星號(hào)表示顯著差異（* p < 0.05）。

加快藥物響應(yīng)速度
電極底座可防止組織接觸 3D 高分辨微電極陣列芯片的底部，從而在組織下方形成微流控通道網(wǎng)格（圖 2G-H）。除了提高組織的存活率外，底部表面下方溶液的流動(dòng)性也會(huì)得到改善，促進(jìn)化合物擴(kuò)散，從而縮短作用時(shí)間。為了驗(yàn)證這一可能性，從放置在平面2D和3D高分辨微電極陣列上的小腦切片中記錄自發(fā)活動(dòng)，分別在灌注含 3 uM河豚毒素（TTX）的克氏液之前和期間進(jìn)行，時(shí)長一分鐘。正如預(yù)期的那樣，TTX 灌流逐漸抑制了放電活動(dòng)（圖 6A）。

然而，放置在 3D高分辨微電極陣列上的切片顯示出更快的抑制速度。在使用TTX處理后的平均放電頻率（神經(jīng)放電率降低 10%、50% 和 90% 時(shí)；所有條件下 p < 0.0001，n = 10 片），其神經(jīng)元活動(dòng)完全受到抑制的時(shí)間早于平面2D HD-MEA 上的切片（圖 6B 和 6C）。這些結(jié)果表明，使用 3D HD-MEA可顯著加快活性化合物的作用，極大的提高實(shí)驗(yàn)效率。

圖6. 3D 高分辨微電極陣列（HD-MEA）與平面 HD-MEA 相比藥物作用加速。為測試藥物灌流的效果，將河豚毒素（TTX）應(yīng)用于急性小腦切片。A）電活動(dòng)圖示例，顯示在 3D 芯片上放置的切片在應(yīng)用 TTX 前（上）和應(yīng)用后（下）的活躍電極分布情況（顏色刻度條：0 – 300uV）。B）該圖展示了在平面和 3D HD-MEA 上放置的小腦切片在 TTX灌流后活躍單元平均放電率（MFR）的歸一化時(shí)間進(jìn)程。平均放電率歸一化為 TTX 應(yīng)用前 1 分鐘的基線活動(dòng)。C）直方圖顯示了兩種條件下 TTX 應(yīng)用后達(dá)到放電頻率降低 10%、50% 或 90% 所需的時(shí)間。直方圖報(bào)告了平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，星號(hào)表示顯著差異，* p < 0.05，** p < 0. 01，*** p < 0.001。

3D電極的電刺激性能
平面2D和3D 高分辨微電極陣列芯片配備了雙向電極，即可用于記錄或者進(jìn)行電刺激。在小腦切片中，顆粒層對(duì)苔蘚纖維刺激的反應(yīng)速度極快，僅需幾毫秒，因此難以檢測。此外，有效的刺激需要穿透組織以觸及內(nèi)部苔蘚纖維�；�于這些原因，3D電極有望在記錄和刺激誘發(fā)的電反應(yīng)方面發(fā)揮關(guān)鍵優(yōu)勢。研究者的結(jié)果表明，苔蘚纖維刺激誘發(fā)了局部場電位（LFP），該電位在每個(gè)受刺激的小葉中傳播（圖 7A），平均傳播速度為 311 ± 39 mm/s（n = 8）。雖然使用 3D 高分辨微電極陣列始終能觀察到快速反應(yīng)（圖 7A），但同樣的刺激方案在平面高分辨微電極陣列記錄中卻無法激活顆粒層。

此外，研究者還測試了對(duì)顆粒層反應(yīng)的藥理學(xué)干預(yù)：阻斷 AMPA 受體（10 µM NBQX，圖 7A）和電壓依賴性 Na+ 通道（3 µM TTX，圖 7A）會(huì)消除該反應(yīng)。這種刺激有效地使信號(hào)在電路中傳播，這從受刺激小葉浦肯野細(xì)胞檢測到的反應(yīng)中可見一斑（圖 7 B、C）。浦肯野細(xì)胞接受顆粒細(xì)胞軸突的突觸聯(lián)系，表明這種刺激能夠有效地激活神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)。浦肯野細(xì)胞的反應(yīng)也會(huì)因 NBQX 的灌流而消失（圖 7 B、C）。

圖 7. 采用3D 高分辨微電極陣列芯片記錄對(duì)小腦切片進(jìn)行電刺激所誘發(fā)的神經(jīng)元活動(dòng)。A）在苔蘚纖維束對(duì)應(yīng)位置使用雙向電極進(jìn)行刺激，在不同小葉的顆粒層誘發(fā)了反應(yīng)。由 NBQX 和 TTX 處理后誘發(fā)的局部場電位（LFP）消失。電刺激通過小腦切片圖像中紅色和綠色點(diǎn)所指示的通道傳遞，活動(dòng)圖疊加在圖像上。顏色刻度條：0 - 300 uV。單條曲線分別代表對(duì)照條件、NBQX 灌注 25 分鐘后以及 TTX 灌注 5 分鐘后的 LFP。B）對(duì)照條件下（CTRL）和 NBQX 灌注后位于刺激小葉的響應(yīng)性浦肯野細(xì)胞的點(diǎn)陣圖和刺激后時(shí)間直方圖（PSTH）。相應(yīng)的原始信號(hào)波形圖見 C）。浦肯野細(xì)胞的爆發(fā)-暫停反應(yīng)跟隨顆粒細(xì)胞的突觸激活，表明刺激有效傳播至網(wǎng)絡(luò)。

在具有挑戰(zhàn)性的樣本上測試 3D 高分辨微電極陣列（HD-MEA）記錄效率-PFC自發(fā)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)記錄
前額葉皮層（PFC）的神經(jīng)環(huán)路活動(dòng)與高級(jí)腦功能相關(guān)，有眾多的科學(xué)家渴望記錄該腦區(qū)的電活動(dòng)。但由于記錄 PFC 自發(fā)活動(dòng)的條件本身就很困難，這一局限性極大的限制了對(duì)這個(gè)腦區(qū)的研究。為了測試 3D 芯片增強(qiáng)的記錄能力是否有助于解決這一問題，研究者首先在生理?xiàng)l件下（即不使用改良的細(xì)胞外溶液來提高神經(jīng)元興奮性）記錄了急性切片中前額葉皮層的腹內(nèi)側(cè)區(qū)（PrL）的自發(fā)活動(dòng)。研究者在 7 個(gè)切片中記錄了 983 個(gè)通道顯示基礎(chǔ)自發(fā)活動(dòng)（> 0.1 Hz），占對(duì) PrL 進(jìn)行采樣的 2284 個(gè)電極的 43%。這些單元的平均放電頻率為 0.71 ± 0.09 Hz。為了進(jìn)一步表征前扣帶回（PrL）的活動(dòng)，研究者通過灌流一種改良的腦脊液（mACSF），其中不含Mg2+，并增加了K+的濃度，來改變神經(jīng)元的興奮性，隨后加入抑制性突觸傳遞阻滯劑（10 µM 戊巴比妥）（圖 8A）。

正如預(yù)期的那樣，這兩種調(diào)整都增加了網(wǎng)絡(luò)的興奮性。有趣的是，研究者還觀察到沿著皮質(zhì)傳播的自發(fā)大規(guī)模事件信號(hào)，表現(xiàn)為局部場電位（LFP）疊加著Spike爆發(fā)（圖8B）。這種現(xiàn)象本質(zhì)上是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步活動(dòng)事件。因此，研究者對(duì)兩組切片（有或無傳播的 LFP）進(jìn)行了表征，以檢測可能存在的基礎(chǔ)活動(dòng)差異，這些差異或許可以解釋為何在灌注戊巴比妥后，只有部分切片出現(xiàn)了陣發(fā)性事件。在缺乏 LFP 的切片組（n = 3；以下稱為組 1）和顯示 LFP 的切片組（n = 4；組 2）之間，基礎(chǔ)放電特性沒有可檢測到的差異。在生理?xiàng)l件下，放電頻率（組 1：363 個(gè)單位，0.63 ± 0.07 Hz；組 2：620 個(gè)單位，0.79 ± 0.12 Hz； t 檢驗(yàn) p = 0.25）

圖 8. 利用 3D 高分辨微電極陣列對(duì)小鼠前扣帶回皮質(zhì)（PrL）電活動(dòng)的表征。A）示例腦切片，展示了置于 3D 高分辨微電極陣列芯片上的局部場電位（LFP）。從左至右：整個(gè)切片，指示 PrL 位置；PrL 區(qū)域的放大圖，顯示了在克氏液、改良人工腦脊液（mACSF）以及加巴噴丁灌注期間的連接圖。每種條件下的 3 分鐘自發(fā)活動(dòng)?xùn)鸥駡D顯示在下方。B）來自 A 中同一切片在每種條件（克氏液、改良人工腦脊液和加巴噴丁）下自發(fā)活動(dòng)記錄的原始跡線示例。點(diǎn)為尖峰標(biāo)記。帶有尖峰的自發(fā) LFP 用條形表示。C）圖中顯示了兩組切片在克氏液中的相關(guān)指數(shù)（CI）（左），以及第 1 組（中）和第 2 組（右）在測試的三種條件下的 CI 百分比變化。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（MSE）的形式報(bào)告。星號(hào)表示顯著差異：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

利用 3D 高分辨微電極陣列測量腦類球體的活動(dòng)
生成能夠維持三維結(jié)構(gòu)的體外細(xì)胞培養(yǎng)物的需求是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，近年來，這一需求促使人們開發(fā)出了越來越復(fù)雜的模型，如類球體和類器官。然而，這類模型通常比體外組織小，細(xì)胞密度也更低。鑒于這些原因，研究者采用了更細(xì)的 3D 高分辨微電極陣列（HD-MEA）以減少針刺可能造成的損傷（圖 2B）。這些芯片在直徑約為 400 微米和 600 微米的兩種大小的原代胚胎神經(jīng)元腦類球體上進(jìn)行了測試。記錄區(qū)域（3.8×3.8 mm2)）允許在同一個(gè)芯片上放置多個(gè)樣本，同時(shí)由于電極密度高，仍能保持良好的空間分辨率。將不同大�。ù�、小）的三個(gè)類球體安裝在兩個(gè)不同的芯片上（圖 9A 左側(cè)面板），放置后立即顯示出活動(dòng)。急性測量顯示存在強(qiáng)烈的尖峰和爆發(fā)活動(dòng)（圖 9A 右側(cè)面板）。盡管三個(gè)相鄰的球體共用相同的培養(yǎng)基，但它們的活動(dòng)并未同步，這在圖9A（中間面板）的柵格圖中顯而易見。因此，研究者將每個(gè)樣本視為彼此獨(dú)立的。較大的球體被更多的電極穿透，因此顯示出更多的電極檢測到活躍細(xì)胞（圖 9B）。

然而，無論是大球體還是小球體，“活躍細(xì)胞/覆蓋電極”的比例都相似（約 1.5），這表明樣本大小并未直接影響電極的傳感/穿透能力。從每個(gè)球體記錄中提取的數(shù)據(jù)被平均以生成按球體大小排序的實(shí)驗(yàn)亞組。兩組的平均放電率、爆發(fā)率和峰峰值幅度如圖 9C 所示。有趣的是，較大的球體顯示出平均放電率和爆發(fā)活動(dòng)增加的趨勢，盡管這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著，而峰峰值幅度則不然（圖 9C）。這表明球體大小并未影響信號(hào)幅度或神經(jīng)元-電極耦合。
 

圖 9. 利用 3D 高分辨微電極陣列記錄小鼠腦類器官的電活動(dòng)。使用了配備更細(xì)電極（寬度 14 微米，高度 65 微米）的 3D 高分辨微電極陣列對(duì)類器官進(jìn)行檢測。A）芯片上小類器官和大類器官的圖片與相應(yīng)的電活動(dòng)圖（左）疊加，該圖顯示了 3D 高分辨微電極陣列電極檢測到的平均放電頻率（顏色標(biāo)度條：0 - 10 次/秒）。中間的柵格圖顯示了 2.5 分鐘內(nèi)的放電活動(dòng)。三個(gè)電極的代表性原始跡線和平均波形如圖所示。）右側(cè)。B）直方圖顯示了對(duì)小球體和大球體進(jìn)行采樣的電極數(shù)量、活躍電極數(shù)量以及活躍單元數(shù)量。C）直方圖顯示了小球體和大球體的平均放電率、峰峰值以及爆發(fā)率。請(qǐng)注意，球體大小并未影響峰峰值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。

利用 3D 高分辨微電極陣列對(duì)類器官活性進(jìn)行化學(xué)調(diào)節(jié)
盡管腦球體具有三維結(jié)構(gòu)，但其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)缺乏典型的自組織發(fā)育特征，這導(dǎo)致細(xì)胞組成和神經(jīng)回路的復(fù)雜性嚴(yán)重不足。為克服這些局限性，腦類器官作為一種新型生物學(xué)模型應(yīng)運(yùn)而生，用于研究人類大腦發(fā)育及疾病。將分別由人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）培養(yǎng) 219 天和 131 天的皮質(zhì)和脊髓類器官置于3D高分辨微電極陣列（HD-MEA）芯片上，并置于其培養(yǎng)基中。急性檢測顯示，皮層類器官中有數(shù)百個(gè)活躍位點(diǎn)表現(xiàn)出自發(fā)的放電和爆發(fā)活動(dòng)（圖 10）。檢測到的高度同步性（圖 11B 的柵格圖中明顯可見）表明存在網(wǎng)絡(luò)激活。通過向培養(yǎng)基中添加 1uM氯化鉀，放電頻率和爆發(fā)頻率分別提高了18%和 14%；

圖 10. 利用 3D 高分辨微電極陣列從人類皮層類器官記錄電活動(dòng)。A）芯片上類器官的圖片與相應(yīng)的連接圖重疊（從左至右：基線、+ 1 uM KCL、+ 5 uM KCL）。連接圖是通過互相關(guān)分析計(jì)算得出。每條連線的顏色根據(jù)其歸一化相關(guān)程度進(jìn)行編碼。紅色和藍(lán)色點(diǎn)分別代表有入向和出向連接的節(jié)點(diǎn)，灰色點(diǎn)代表同時(shí)有入向和出向連接的節(jié)點(diǎn)。B）表示每種實(shí)驗(yàn)條件下隨時(shí)間變化的活動(dòng)模式的柵格圖。黑色點(diǎn)A）檢測到的尖峰用藍(lán)色標(biāo)記，紅線表示介質(zhì)中 [K+] 的變化。C）直方圖分別顯示了用于確定活動(dòng)和網(wǎng)絡(luò)同步性的放電和爆發(fā)指標(biāo)。D）直方圖顯示了由互相關(guān)分析得出的連接強(qiáng)度和數(shù)量。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。E）每個(gè)記錄階段的代表性軌跡，展示了尖峰活動(dòng)的調(diào)制情況。星號(hào)表示顯著差異：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

球體和類器官的記錄
3D 高分辨微電極陣列（HD-MEAs）也被證明適用于記錄神經(jīng)球體和類器官。值得注意的是，腦球體的細(xì)胞密度低于腦切片，且體積更�。ㄍǔＶ挥袔装傥⒚祝�，這使得在同一樣本中從多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行記錄頗具挑戰(zhàn)性。因此，用于這些記錄的更小的電極尺寸可能至關(guān)重要。有趣的是，可以在同一3D HD-MEA 上記錄多個(gè)球體，從而有可能同時(shí)測試多個(gè)樣本。

對(duì)于類器官而言，能夠進(jìn)行急性測量而無需在芯片上培養(yǎng)數(shù)天，避免了在平面微電極陣列上常見的細(xì)胞遷移效應(yīng)。這帶來了兩個(gè)主要優(yōu)勢：首先，它形成了由于細(xì)胞遷移而形成的二維網(wǎng)絡(luò)；其次，它能防止三維結(jié)構(gòu)的改變或壞死核心的增大，這種情況通常會(huì)在類器官在自由漂浮環(huán)境中生長后被固定時(shí)發(fā)生。此外，研究者能夠調(diào)節(jié)皮質(zhì)和脊髓類器官的放電頻率和同步性，而在這些類器官中進(jìn)行此類操作通常是困難的。實(shí)際上，氯化鉀誘導(dǎo)的膜去極化已知能有效調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)連接性。

圖 11. 利用 3D 高分辨電極陣列記錄人類脊髓類器官的電活動(dòng)。A）尖峰圖，顯示了在三種測試條件下芯片上每個(gè)電極的平均放電率（從左至右：基線、+ 1 mM、+ 5 mM KCl）。B）柵格圖，顯示了每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的活動(dòng)模式隨時(shí)間的變化。黑色點(diǎn)表示檢測到的Spike。紅色線表示培養(yǎng)基中鉀離子濃度的變化；黃色突出顯示了爆發(fā)。C）直方圖顯示了放電和爆發(fā)的指標(biāo)，用于確定活動(dòng)和網(wǎng)絡(luò)同步性。D）提高 KCl 濃度導(dǎo)致1 毫摩爾的氯化鉀（KCl）導(dǎo)致爆發(fā)中Spike數(shù)量增加，但這種增加并不顯著。相反，更高的氯化鉀濃度（+5 毫摩爾）使爆發(fā)中的Spike數(shù)量恢復(fù)到基線水平（p < 0.0001，n = 230），并增加了爆發(fā)Spike間隔的不規(guī)則性（p < 0.05，n = 230）。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。 E）每個(gè)記錄階段的代表性軌跡顯示了脈沖活動(dòng)的調(diào)節(jié)情況。星號(hào)表示顯著差異，* p < 0.05，** p < 0.01，**** p < 0.0001。

結(jié)論
3D 高分辨微電極陣列（HD-MEA）技術(shù)提高了3D生物模型中電生理記錄和刺激的效率。本文作者認(rèn)為這項(xiàng)工作為解答此前懸而未決的特定實(shí)驗(yàn)問題奠定了基礎(chǔ)。例如，要繪制腦切片（如大腦皮層、小腦和海馬體）中電信號(hào)的分布情況，并解決生理學(xué)和計(jì)算問題，就需要高分辨率的記錄和刺激位點(diǎn)。3D高分辨微極陣列還為在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)和維持的球體和類器官中探索神經(jīng)活動(dòng)提供了穩(wěn)定且可靠的調(diào)節(jié)，有助于縮小動(dòng)物組織和人類組織觀察結(jié)果之間的差距。在所有這些準(zhǔn)備工作中，將使得灌流的藥物產(chǎn)生更快、更徹底的液體和分子交換，提高給藥效率。因此，結(jié)合3D高分辨微電極陣列所提供的優(yōu)勢，研究者將能夠研究神經(jīng)元活動(dòng)和突觸可塑性的時(shí)空動(dòng)態(tài)以及藥物的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。最后，從同一樣本中數(shù)千個(gè)相互連接的神經(jīng)元的同步記錄中獲得的大量數(shù)據(jù)，非常適合用于指導(dǎo)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算模型，從而深入了解神經(jīng)回路的組織和神經(jīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制。