MEA-seqX在解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)跨尺度動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用

圖 1｜MEA-seqX 跨尺度神經(jīng)研究框。

MEA-seqX 在同一腦組織樣本中整合 3Barin 高分辨率微電極陣列電生理記錄、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組織成像數(shù)據(jù) (a–d)。通過(guò)空間配準(zhǔn)將不同模態(tài)數(shù)據(jù)映射到統(tǒng)一的組織坐標(biāo)系中 (e)，并進(jìn)一步通過(guò)多模態(tài)計(jì)算分析解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及細(xì)胞類型特征 (g)，從而建立神經(jīng)活動(dòng)與基因表達(dá)之間的跨尺度關(guān)聯(lián)。

3Brain HD-MEA 記錄海馬–皮層腦片多區(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)
研究團(tuán)隊(duì)利用 3Brain 高分辨率微電極陣列平臺(tái)對(duì)小鼠海馬–皮層急性腦片進(jìn)行大規(guī)模神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理記錄，并行采集來(lái)自齒狀回 (DG)、Hilus、CA3、CA1以及內(nèi)嗅皮層 (EC) 等多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)信號(hào)（圖1a），構(gòu)建具有空間坐標(biāo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)圖譜。隨后，研究者從局部場(chǎng)電位LFP信號(hào)中提取多種網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征，包括LFP 振幅 (amplitude)、事件頻率 (rate)、信號(hào)傳播延遲 (delay) 以及振蕩能量 (energy)，用于描述海馬網(wǎng)絡(luò)的整體活動(dòng)模式（圖2a）。

研究團(tuán)隊(duì)隨后將這些電生理特征與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在齒狀回和 CA3 等關(guān)鍵海馬區(qū)域，多種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)指標(biāo)與局部基因表達(dá)模式之間存在顯著空間關(guān)聯(lián)（圖2a）。在豐富環(huán)境 (enriched environment) 條件下，LFP 振幅和事件頻率等指標(biāo)與基因表達(dá)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明環(huán)境經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌蛲瑫r(shí)影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與分子表達(dá)狀態(tài)（圖2a）。

除了量化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)強(qiáng)度，研究團(tuán)隊(duì)還對(duì)記錄到的 LFP 波形形態(tài)進(jìn)行分類。通過(guò)主成分分析結(jié)合聚類算法，研究者識(shí)別出不同海馬層級(jí)中具有區(qū)域特征的振蕩波形模式（圖2b），揭示海馬網(wǎng)絡(luò)在空間上呈現(xiàn)出明顯的功能分層。

研究者進(jìn)一步在網(wǎng)絡(luò)連接層面 (network connectivity) 分析電極之間的活動(dòng)相關(guān)性 (pairwise firing correlation)，并據(jù)此構(gòu)建海馬網(wǎng)絡(luò)的功能連接圖譜。結(jié)果顯示，在豐富環(huán)境條件下，海馬網(wǎng)絡(luò)的連接強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，跨區(qū)域神經(jīng)活動(dòng)同步程度更高（圖2c）。基于 LFP 信號(hào)構(gòu)建的相關(guān)矩陣也呈現(xiàn)出類似趨勢(shì)，提示豐富環(huán)境條件下海馬網(wǎng)絡(luò)整體振蕩的協(xié)調(diào)性明顯提升（圖2d）。

在此基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)一步從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (network topology) 的角度分析海馬網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)圖論分析方法 (graph-theoretic analysis)，研究者識(shí)別出網(wǎng)絡(luò)中的高度連接節(jié)點(diǎn) (hub nodes) 以及由這些節(jié)點(diǎn)組成的“富集俱樂(lè)部” (rich-club) 結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在環(huán)境豐富化條件下，海馬網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)更多高度連接的樞紐節(jié)點(diǎn)，并形成更明顯的rich-club 組織，表明不同海馬區(qū)域之間建立了更緊密的功能連接（圖2e）。
 

圖 2｜3Brain 高分辨率解析小鼠海馬體-皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)

(a) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與基因表達(dá)之間的空間關(guān)聯(lián)。橫軸表示不同的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征（如 LFP 振幅、事件頻率、傳播延遲等），縱軸表示在空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序位點(diǎn)中 (SRT spot)，與這些電生理特征顯著相關(guān)的基因表達(dá)模式數(shù)量。灰色表示標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，藍(lán)色表示豐富環(huán)境條件 (ENR)。柱狀體越高，說(shuō)明該網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征與更多基因表達(dá)存在空間關(guān)聯(lián)。

(b) 不同海馬區(qū)域的LFP波形模式。灰色曲線表示檢測(cè)到的LFP振蕩事件的單次波形，彩色曲線表示該類事件的平均波形。橫軸為時(shí)間 (ms)，縱軸為電壓幅度 (µV)。

(c) 神經(jīng)元共放電構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)連接圖。矩陣中的每個(gè)方格表示成對(duì)放電電極之間神經(jīng)元放電spike活動(dòng)的相關(guān)性 (Pearson correlation coefficient, PCC)。顏色越深表示電極之間成對(duì)放電活動(dòng) (pairwise firing) 的相關(guān)性越高，反映更強(qiáng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接。

(d) 海馬不同腦區(qū)之間的 LFP 活動(dòng)相關(guān)性。柱狀圖展示不同腦區(qū)對(duì)之間LFP 信號(hào)的相關(guān)性 (PCC)。柱狀體越高表示兩個(gè)腦區(qū)之間的神經(jīng)活動(dòng)同步性越強(qiáng)。

(e) 海馬網(wǎng)絡(luò)連接的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)神經(jīng)活動(dòng)記錄位置，連線表示兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在顯著的神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)性。為便于展示整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，僅顯示約 2% 的連接關(guān)系（SD：node = 1057，links = 24217；ENR：node = 2003，links = 36312）。節(jié)點(diǎn)大小根據(jù)其連接度 (degree) 進(jìn)行縮放，即該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)建立連接的數(shù)量；節(jié)點(diǎn)越大表示其與更多節(jié)點(diǎn)存在功能連接。不同顏色表示節(jié)點(diǎn)所屬的海馬區(qū)域，彩色連線表示區(qū)域內(nèi)或區(qū)域之間的功能連接。中間的圓形圖展示網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)，其中 hub nodes 表示具有較高連接度的節(jié)點(diǎn)，rich-club 表示這些高連接節(jié)點(diǎn)之間形成的高度互聯(lián)結(jié)構(gòu)。左側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，右側(cè)為豐富環(huán)境 (ENR)。

機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)一步解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)
在使用 3Brain HD-MEA 獲得大規(guī)模電生理數(shù)據(jù)后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的多尺度結(jié)構(gòu)。首先，研究者采用非負(fù)矩陣分解 (Non-negative Matrix Factorization, NMF) 將復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)拆解為多個(gè)具有特定空間分布和時(shí)間特征的網(wǎng)絡(luò)模塊 (network modules)，從而識(shí)別不同海馬亞區(qū)之間的功能子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3a）。

在此基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)一步分析神經(jīng)活動(dòng)在腦片中的傳播動(dòng)態(tài)。通過(guò)計(jì)算神經(jīng)活動(dòng)傳播軌跡中心 (center of activity trajectory, CAT)，可以追蹤神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)在不同海馬區(qū)域之間的傳播方向，從而描繪海馬網(wǎng)絡(luò)中的信息傳播路徑（圖3b）。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法 XGBoost (Chen & Guestrin, 2016) 探索基因表達(dá)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)之間的預(yù)測(cè)關(guān)系。模型根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)多個(gè)關(guān)鍵電生理指標(biāo)，例如LFP 事件頻率、振幅以及信號(hào)傳播延遲（原文附圖8）。預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際電生理測(cè)量值之間表現(xiàn)出較高一致性 (Pearson r ≈ 0.9)，說(shuō)明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征在很大程度上可以由基因表達(dá)模式進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖 3｜機(jī)器學(xué)習(xí)解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)

(a) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與基因表達(dá)之間的空間關(guān)聯(lián)分布。圖中展示在不同海馬區(qū)域中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征 (LFP 事件頻率) 與多種神經(jīng)功能相關(guān)基因表達(dá)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。每一列代表一個(gè)基因，每一行代表一個(gè)空間位置。顏色越深，表示該位置的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與該基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)越強(qiáng)。上圖為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，下圖為豐富環(huán)境條件 (ENR)。

(b) 非負(fù)矩陣分解識(shí)別的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)–基因表達(dá)關(guān)聯(lián)模塊。研究者利用非負(fù)矩陣分解 (NMF) 將復(fù)雜的電生理特征與基因表達(dá)數(shù)據(jù)拆解為多個(gè)潛在因子 (NMF factors)。圖中每個(gè)小圖對(duì)應(yīng)一個(gè)因子，曲線表示該因子在不同網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征中的貢獻(xiàn)權(quán)重。不同顏色表示該因子中貢獻(xiàn)最大的代表基因。

3D HD-MEA腦片電生理與多模態(tài)分析實(shí)驗(yàn)流程
為系統(tǒng)研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與基因表達(dá)之間的關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合 3Brain HD-MEA 電生理記錄與空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建跨尺度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能圖譜。整體實(shí)驗(yàn)流程如下 (具體 workflow 詳見(jiàn)原文附圖 1）。

01. 腦片制備與接種
小鼠海馬–皮層急性腦片（厚度約 300 μm）在氧合的人工腦脊液中制備，并在 34 °C 條件下孵育約 45 分鐘恢復(fù)組織活性，隨后在室溫下繼續(xù)恢復(fù)至少1 小時(shí)后用于電生理記錄。記錄過(guò)程中持續(xù)灌流氧合的記錄液（95% O₂ / 5% CO₂），以維持穩(wěn)定的離子環(huán)境和組織活性。

在記錄過(guò)程中，腦片通過(guò)鉑金固定框 (platinum harp) 穩(wěn)定放置于 3Brain 高分辨率微電極陣列芯片表面，并在恒溫灌流系統(tǒng)中進(jìn)行記錄。灌流速率約為4.5 mL min⁻¹，記錄溫度維持在 37 °C，以保證腦片在長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的穩(wěn)定性。

02. HD‑MEA 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理數(shù)據(jù)采集
在該系統(tǒng)中，芯片集成的放大電路提供 0.1–5 kHz 帶通濾波，并具有 60 dB 的全局增益 (global gain)，可同時(shí)記錄慢速與快速神經(jīng)振蕩信號(hào)。細(xì)胞外電信號(hào)以 14 kHz / 電極的采樣率進(jìn)行采集，每次實(shí)驗(yàn)持續(xù)10 分鐘，連續(xù)記錄腦片中的細(xì)胞外電活動(dòng)。

基于這些連續(xù)記錄的數(shù)據(jù)，研究者以 1 Hz 的時(shí)間分辨率提取神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)事件，即按每秒一次的時(shí)間尺度對(duì)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。為增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的興奮強(qiáng)度，在記錄液中加入100 μM 4AP以誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng)。

此外，系統(tǒng)集成了一套定制模塊化立體顯微鏡，在電生理記錄后對(duì)同一腦片進(jìn)行光學(xué)成像。隨后通過(guò) 3Brain 配套軟件 BrainWave 將圖像與電極陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行疊加 (merge)，從而建立腦片組織結(jié)構(gòu)與 HD-MEA 電極布局之間的空間對(duì)應(yīng)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)活動(dòng)與腦區(qū)結(jié)構(gòu)的精確對(duì)齊。

03. 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩信號(hào)提取與波形分類
獲得原始電生理信號(hào)后，研究者首先從寬帶細(xì)胞外記錄中提取局部場(chǎng)電位LFP。隨后通過(guò)硬閾值檢測(cè)算法 (hard threshold algorithm) 識(shí)別網(wǎng)絡(luò)振蕩事件，并使用四階Butterworth 低通濾波器（一種常見(jiàn)的信號(hào)處理方法，用于保留低頻信號(hào)并去除高頻噪聲）在 1–100 Hz 頻段對(duì)信號(hào)進(jìn)行濾波，以提取反映神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)群體活動(dòng)的 LFP 振蕩信號(hào)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的多個(gè)特征進(jìn)行量化分析，包括LFP 事件發(fā)生頻率、振蕩振幅、振蕩能量、神經(jīng)信號(hào)傳播延遲以及振蕩峰值數(shù)量，用于描述海馬網(wǎng)絡(luò)在不同空間位置的活動(dòng)模式。

為了進(jìn)一步比較不同腦區(qū)之間的振蕩特征，研究者對(duì)記錄到的 LFP 波形進(jìn)行模式分類分析。具體而言，通過(guò)主成分分析 (principal component analysis, PCA) 提取波形的主要特征，再結(jié)合 K-means 聚類算法對(duì)振蕩波形進(jìn)行分組，從而識(shí)別不同海馬結(jié)構(gòu)層級(jí)中具有代表性的振蕩模式及其空間分布。

04. 電生理特征與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合分析
為分析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)與基因表達(dá)模式之間的關(guān)系，研究者將提取的電生理網(wǎng)絡(luò)特征與同一腦片獲得的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。首先，通過(guò) Spearman 相關(guān)分析評(píng)估不同空間位置的基因表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)特征之間的關(guān)聯(lián)程度，以量化轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜系與電生理活動(dòng)之間的空間對(duì)應(yīng)關(guān)系。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用 XGBoost 機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理特征進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 (Chen & Guestrin, 2016)。模型以約 70% 的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，用于學(xué)習(xí)基因表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)之間的關(guān)系，并以剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估。預(yù)測(cè)的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)指標(biāo)包括LFP事件頻率、振蕩振幅以及神經(jīng)信號(hào)傳播延遲等特征，用于分析轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)之間的多尺度關(guān)聯(lián)。