電生理技術(shù)助力MYOM1缺乏通過破壞肌漿網(wǎng)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病研究

基于此，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院舒強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院郭曉令教授團(tuán)隊(duì)在Redox Biology（IF11.9) 雜志發(fā)表題為“MYOM1 deficiency leads to dilated cardiomyopathy by disrupting the homeostasis of sarcoplasmic reticulum”的研究論文。

一、測(cè)序與生物信息學(xué)分析
●單核RNA測(cè)序（snRNA-Seq）：分析GEO數(shù)據(jù)庫樣本，鑒定心臟細(xì)胞類型，明確MYOM1在心肌細(xì)胞中特異性高表達(dá)且心衰時(shí)下調(diào)。
●全外顯子測(cè)序（WES）與關(guān)聯(lián)分析：借助UK Biobank數(shù)據(jù)，探究MYOM1罕見變異與擴(kuò)張型心肌病的關(guān)聯(lián)性。
●轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：對(duì)小鼠心臟組織測(cè)序，分析差異表達(dá)基因及相關(guān)富集通路。

二、動(dòng)物模型構(gòu)建
●心肌細(xì)胞特異性Myom1敲除小鼠模型：運(yùn)用CASAAV技術(shù)，構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性Myom1敲除小鼠模型。

三、心臟功能與形態(tài)學(xué)檢測(cè)
●超聲心動(dòng)圖與心電圖：檢測(cè)小鼠心臟功能、心腔結(jié)構(gòu)及心電節(jié)律是否異常。
●組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：通過蘇木精 - 伊紅（H&E）和麥胚凝集素（WGA）染色，觀察心肌形態(tài)與細(xì)胞大小變化。
●透射電鏡（TEM）：觀察心肌肌節(jié)、M帶結(jié)構(gòu)及線粒體超微結(jié)構(gòu)。

四、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
●原代心肌細(xì)胞分離：采用膠原酶灌注法分離小鼠原代心肌細(xì)胞并培養(yǎng)。
●熒光成像與染色：經(jīng)特異性染色，觀察蛋白定位、線粒體數(shù)量及形態(tài)特征。
●PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）：檢測(cè)基因敲除效率及目標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平。
●蛋白質(zhì)印跡（Western blot）：檢測(cè)心肌組織中目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

五、心臟電生理與鈣信號(hào)分析
●離體心臟Langendorff灌流：取4周齡小鼠心臟進(jìn)行體外灌流，維持恒溫恒氧環(huán)境，加入blebbistatin降低心臟自主活動(dòng)，為后續(xù)光學(xué)標(biāo)測(cè)做準(zhǔn)備。
●光學(xué)標(biāo)測(cè)技術(shù)（Optical Mapping System/MappingLab）：通過灌流加載Rh237和Rhod2-AM熒光染料，同時(shí)記錄心肌細(xì)胞膜電位和鈣信號(hào)，利用OMapScope軟件分析動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度、APD90、鈣傳導(dǎo)速度、CTD90等指標(biāo)，探究電生理與鈣瞬變異常。

圖2 不同處理組小鼠的心臟功能與形態(tài)學(xué)評(píng)估
 

圖3 MYOM1基因缺陷誘導(dǎo)心肌病理性重構(gòu)

4. Myom1缺乏導(dǎo)致心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體出現(xiàn)數(shù)量與形態(tài)的雙重異常
細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面檢測(cè)顯示，Myom1高劑量敲除組心肌特異性蛋白及 MYOM1表達(dá)大幅減少。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其肌節(jié)和M帶結(jié)構(gòu)被破壞，Z盤間肌節(jié)間距增加，心肌細(xì)胞體積增大，肌節(jié)完整性受損。同時(shí)，透射電鏡和熒光染色證實(shí)敲除組小鼠心肌線粒體數(shù)量減少、面積縮小，線粒體嵴出現(xiàn)畸形改變，相關(guān)基因檢測(cè)顯示線粒體穩(wěn)態(tài)失衡，表明Myom1缺乏同時(shí)造成肌節(jié)結(jié)構(gòu)破壞和線粒體結(jié)構(gòu)、功能異常。

圖4 4周齡小鼠心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)與線粒體的特征分析

5. Myom1缺乏導(dǎo)致小鼠心臟電生理紊亂，鈣信號(hào)傳導(dǎo)與處理能力顯著受損
采用離體心臟光學(xué)標(biāo)測(cè)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Myom1高劑量敲除組小鼠在竇律狀態(tài)下出現(xiàn)心室動(dòng)作電位傳導(dǎo)減慢，復(fù)極化和去極化時(shí)程延長的電生理異常，且該異常結(jié)果在心臟心尖部給予8Hz刺激時(shí)，可得到一致結(jié)果。鈣信號(hào)檢測(cè)顯示，敲除組小鼠鈣傳導(dǎo)速度減慢，鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程延長，細(xì)胞內(nèi)鈣釋放效率降低，肌漿網(wǎng)鈣處理功能受損。心律失常誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除組小鼠心室有效不應(yīng)期延長，誘發(fā)心律失常所需刺激電流升高，還出現(xiàn)動(dòng)作電位交替，提示Myom1缺乏引發(fā)電生理紊亂和鈣穩(wěn)態(tài)失衡，顯著增加致心律失常風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 離體心臟自主節(jié)律下動(dòng)作電位與鈣瞬變的光學(xué)標(biāo)測(cè)分析

6. Myom1缺乏導(dǎo)致線粒體能量代謝關(guān)鍵蛋白下調(diào)，肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)核心蛋白表達(dá)異常
通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)線粒體和肌漿網(wǎng)關(guān)鍵蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Myom1高劑量敲除組小鼠的線粒體氧化磷酸化關(guān)鍵亞基和蘋果酸 - 天冬氨酸穿梭核心蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，能量代謝功能障礙。肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著降低，從而導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡。同時(shí)鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的PLN磷酸化和CaMKII激活水平上調(diào)，為心肌細(xì)胞的代償性調(diào)節(jié)，但無法逆轉(zhuǎn)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。

 

圖6 MYOM1基因缺陷誘導(dǎo)線粒體和肌漿網(wǎng)功能異常

結(jié)論：
整合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確了MYOM1缺乏導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的完整分子通路：MYOM1缺失首先破壞心肌細(xì)胞M帶結(jié)構(gòu)完整性，引發(fā)肌節(jié)功能異常和解體；進(jìn)而導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)關(guān)鍵蛋白表達(dá)下調(diào)，造成細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡與心肌興奮 - 收縮耦聯(lián)障礙；同時(shí)繼發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，引發(fā)能量代謝障礙。肌節(jié)功能異常與線粒體能量代謝障礙共同作用，導(dǎo)致心肌收縮力生成和傳遞缺陷，進(jìn)而引發(fā)左心室收縮功能障礙和心腔擴(kuò)張，最終形成伴射血分?jǐn)?shù)降低的擴(kuò)張型心肌病。

圖7 MYOM1基因缺陷導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的作用機(jī)制圖