離體心臟NADH熒光標測技術(shù)探究缺血再灌注對心肌及電生理特性的影響

基于此，本研究將可穩(wěn)定維持離體心臟生理活性的Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，與能夠精準捕捉熒光信號的高分辨熒光標測技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了離體心臟NADH熒光標測技術(shù)。該技術(shù)無需對NADH進行外源性染料負載，可同步檢測心肌電生理指標，實驗條件可控性強，能夠?qū)崟r、精準地捕捉NADH熒光信號的動態(tài)變化，有效排除體內(nèi)復雜生理因素的干擾，為離體心臟的多模態(tài)功能檢測提供了穩(wěn)定可靠的技術(shù)平臺。

NADH 與動作電位的同步光學標測，突破了傳統(tǒng)心臟電生理研究只能單一檢測電活動、無法同步解析能量代謝與電興奮交互調(diào)控的技術(shù)瓶頸，實現(xiàn)代謝‑興奮耦聯(lián)同視野、高時空分辨率動態(tài)捕捉，可闡明心肌生理病理狀態(tài)下代謝變化與電生理重構(gòu)的因果時序，精準識別藥物心臟靶向效應與脫靶風險，彌補傳統(tǒng)心臟安全性篩查不足，為心肌保護、心律失常機制研究與藥物研發(fā)提供創(chuàng)新視角與標準化技術(shù)工具。

實驗目的：
利用Langendorff灌流維持大鼠離體心臟的正常生理活動；利用高分辨熒光標測技術(shù)同步檢測心肌缺血再灌注過程中NADH熒光幅值及心肌電生理相關(guān)指標的動態(tài)變化，探究缺血再灌注對心肌能量代謝及電生理特性的影響。

實驗動物：
SD大鼠

實驗方法：

2. 高分辨熒光標測技術(shù)原理：在可興奮樣本上負載熒光染料，通過高速相機記錄熒光變化來反應樣本中各種離子濃度的變化，也可同步記錄動作電位與鈣信號等指標的改變。

Protocol（大鼠心臟NADH與動作電位同步標測）

一、實驗前準備
（一）主要試劑
KH灌流液、Blebbistatin、RH237、肝素鈉、異氟烷

（二）主要器材
手術(shù)剪、眼科剪、眼科彎鑷、止血鉗、手術(shù)縫線、注射器、主動脈插管、主動脈夾、培養(yǎng)皿

（三）主要溶液配方
1. KH solution（灌流液）

注：KCl、KH₂PO₄、MgCl₂可配制為10×母液；溶液配好后需經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾；使用前，提前30min充氧（95% O₂， 5% CO₂）飽和。

2. 興奮-收縮解耦聯(lián)劑Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/mL，分裝為100µL/tube， -20℃儲存?zhèn)溆�。（摩爾質(zhì)量292g/mol）

3. 電壓敏感染料RH237，DMSO溶解為1mg/mL，分裝為100µL/tube。

注：NADH在紫外光下（365nm）自發(fā)熒光，無需進行熒光染料負載；為避免反復凍融，將染料提前配制并進行分裝儲存于-20 ℃。

4. 肝素鈉(1000U/mL)：用生理鹽水稀釋為所需濃度。

二、大鼠心臟獲取與處理
1. 對SD大鼠進行稱重后，腹腔注射肝素鈉（3125U/kg），待15~20min后采用異氟烷麻醉，隨后脫頸處死。

2. 將處死的大鼠固定于實驗臺，對腹部區(qū)域噴灑酒精消毒；剪開胸部皮膚暴露劍突，用鑷子夾起劍突并沿左、右肋中部剪開胸腔，充分暴露心臟。夾起肺葉提起心臟，沿肺后部快速剪取心臟，立即置于預充氧（95％O₂，5％CO₂）的KH灌流液中。

3. 剝離心臟表面多余組織，清晰暴露主動脈；在鑷子輔助下將主動脈快速套入灌流針，用主動脈夾固定后，以4-0手術(shù)縫線結(jié)扎主動脈與灌流針連接處（注：排除氣泡）；采用KH灌流液對心臟進行逆行灌流，調(diào)節(jié)灌流速率至10mL/min，維持灌注壓在60~70mmHg，持續(xù)灌流15~20min，排出心臟內(nèi)殘余血液，使心臟恢復并維持正常節(jié)律。

4. 待心臟灌流狀態(tài)穩(wěn)定、無殘血流出后，將灌流體系切換為2號罐中預充氧的100mL KH灌流液，進行循環(huán)灌流。

三、心臟停跳及熒光染色（全過程均在避光環(huán)境下進行）
1. 心臟停跳：從灌流體系給藥口注入300μL Blebbistatin至100mL循環(huán)KH灌流液中，通過高濃度藥物作用減少心肌運動偽跡，觀察至心肌收縮完全停止，全程約1~2min。

2. 熒光染料負載：向100mL 循環(huán)灌流體系中加入100μL 電壓敏感染料RH237，持續(xù)循環(huán)灌流15min，使染料充分負載于心肌組織。

3. 實驗設備調(diào)試：按順序開啟高速相機、LED激發(fā)光源（520nm光源用于激發(fā)電壓敏感染料RH237，365nm光源用于激發(fā) NADH自發(fā)熒光）、電刺激器、主機及電腦終端，隨后啟動OS、OR熒光信號分析與記錄軟件，完成設備預熱與參數(shù)初始化。

高分辨熒光標測技術(shù)原理示意圖