Pipetty電動(dòng)移液器在馬流感SRH實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案整合Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)控量、連續(xù)移液、操作穩(wěn)定以及防交叉污染等核心優(yōu)勢(shì)，對(duì)馬流感SRH（單向輻射溶血試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)中的樣品處理、抗原稀釋、反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)予以規(guī)范化。此舉能夠有效規(guī)避手動(dòng)移液過程中易出現(xiàn)的移液誤差、操作效率低下以及樣品交叉污染等問題。充分發(fā)揮該移液器移液精準(zhǔn)度高、重復(fù)性強(qiáng)、操作便捷的特性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、一致性與可靠性，為馬流感的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)化操作的依據(jù)。該方案適用于動(dòng)物疫病防控機(jī)構(gòu)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室等開展馬流感血清抗體檢測(cè)工作，有助于提升檢測(cè)工作的效率與質(zhì)量。
 
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
馬流感SRH（單向輻射溶血試驗(yàn)）是基于抗原-抗體-補(bǔ)體反應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)方法，核心原理為：馬流感病毒（H3N8亞型EIV）致敏綿羊紅細(xì)胞后，與待檢血清中的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致致敏綿羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，形成肉眼可見的溶血圈。溶血圈的大小與血清中特異性抗體的含量呈正相關(guān)，通過測(cè)量溶血圈面積，可判定待檢血清中馬流感抗體的陽性與否，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)馬流感的血清學(xué)檢測(cè)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 離心機(jī)；
③ 恒溫箱；
④ 微波爐；
⑤ 水浴鍋；
⑥ 振蕩器；
⑦ 濕盒；
⑧ 游標(biāo)卡尺。
 
2、試劑和材料
① 96孔V型或U型微量反應(yīng)板；
② 鹽水/HEPES；
③ 綿羊紅細(xì)胞液;
④ 鹽水/HEPES/BSA；
⑤ H3N8亞型EIV活病毒。
⑥ 氯化鉻工作液；
⑦ PBS“A”；
⑧ 1%瓊脂糖；
⑨ 補(bǔ)體，商品化豚鼠補(bǔ)體，或豚鼠血清；
⑩ 陽性血清和陰性血清；
⑪ 免疫擴(kuò)散平板或平皿(直徑6cm)。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、使用Pipetty電動(dòng)移液器移取適量待檢血清至離心管中，置于56℃水浴鍋滅活30 min，滅活后分裝置于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
2、用Pipetty移取鹽水/HEPES緩沖液，洗滌綿羊紅細(xì)胞，至少洗滌3次：第1次1500 r/min，離心5 min；第2次、第3次洗滌后，1500 r/min，離心10 min。洗滌完成后，移取適量鹽水/HEPES緩沖液，配制8%綿羊紅細(xì)胞懸液，輕輕振蕩混勻，備用。
3、用Pipetty，分別移取0.6 mL、1.2mL、1.8 mL H3N8亞型EIV病毒液，至含有2 mL 8%綿羊紅細(xì)胞懸液中，分別標(biāo)記為病毒液A、病毒液B、病毒液C，置于2°C~8°C冰箱中孵育10min。設(shè)不致敏紅細(xì)胞，即不加病毒的紅細(xì)胞作空白對(duì)照板。
 
4、用Pipetty分別移取0.3mL、0.6 mL、0.9 mL、1 mL氯化鉻工作液（生理鹽水1:400稀釋），緩慢加入病毒液A、病毒液B、病毒液C和2mL空白對(duì)照不致敏紅細(xì)胞中，每加入1管后輕輕搖動(dòng)混合，置于22°C（±2°C）室溫下靜置5min。1500 r/min離心10 min，棄上清液。
5、用Pipetty移取適量鹽水/HEPES/BSA緩沖液，輕輕混懸紅細(xì)胞沉淀，再次1500 r/min離心10 min，棄上清液。2mL PBS“A”緩沖液重懸紅細(xì)胞沉淀，此時(shí)紅細(xì)胞濃度維持為8%。
6、使用Pipetty分別移取0.9mL病毒液A、病毒液B、病毒液C致敏的紅細(xì)胞液，加入至3支含有7.8mL融化瓊脂糖的試管中，迅速輕輕混合均勻，再加入0.3mL補(bǔ)體，輕輕混合后，立即倒入置于水平桌面上的免疫擴(kuò)散平板或平皿中，不加蓋，自然風(fēng)干5min。
7、反應(yīng)板加蓋，置于濕盒中，2°C~8°C冰箱存放，制備好的反應(yīng)板可保存數(shù)周。
8、按上述步驟，使用未致敏的綿羊紅細(xì)胞制備空白對(duì)照板，用于排除非特異性溶血反應(yīng)。在制備好的免疫擴(kuò)散板上距平板邊緣至少6mm處打孔，孔徑3mm，孔距12mm。
9、用Pipetty分別吸取10μL陽性血清、陰性血清，緩慢加入同一致敏反應(yīng)板的相應(yīng)孔中，置于濕盒中，34℃恒溫箱孵育20h。孵育完成后，取出反應(yīng)板，用游標(biāo)卡尺測(cè)量陽性血清產(chǎn)生的溶血圈直徑，扣除孔面積，計(jì)算溶血面積。
 
10、對(duì)比病毒液A、病毒液B、病毒液C致敏紅細(xì)胞制備的反應(yīng)板，選擇陽性血清產(chǎn)生溶血環(huán)最大、最清晰的反應(yīng)板對(duì)應(yīng)的病毒液用量，作為最佳病毒液用量，后續(xù)待檢血清檢測(cè)均使用該用量制備反應(yīng)板。
11、將處理好的待檢血清，以及陽性、陰性對(duì)照血清，用Pipetty電動(dòng)移液器分別吸取10μL，加入同一個(gè)反應(yīng)板加樣孔中，每孔對(duì)應(yīng)1份樣品，做好清晰標(biāo)記，置于濕盒中，34℃恒溫箱孵育20h。孵育完成后，測(cè)量各孔溶血圈直徑，扣除孔面積，計(jì)算溶血面積。
 
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立的條件
陰性血清無溶血圈，陽性血清產(chǎn)生溶血環(huán)，且直徑>5mm，空白對(duì)照板上血清無溶血圈。
2、陽性
出現(xiàn)溶血圈，判定為EIV抗體陽性。
3、陰性
無溶血圈，判定為EIV抗體陰性。