Pipetty電動移液器在馬流感AC-ELISA實驗中的應用

方案摘要：本方案意在明確Pipetty電動移液器于馬流感AC - ELISA（抗原競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗）里的具體應用流程，規(guī)范實驗操作步驟，借助該移液器精準、高效、能連續(xù)分液的優(yōu)點，降低移液誤差，提高實驗結果的準確性與重復性，為馬流感病毒（EIV）抗原的快速、精確檢測提供標準化實驗依據(jù)。
 
 
方案詳情：

• 實驗原理

將 EIV 單克隆抗體包被在微孔板上，加入待檢樣品與酶標抗體，樣品中的 EIV 抗原會與酶標抗體競爭結合包被抗體。若樣品為陽性，競爭結合導致酶標抗體無法固定，顯色淺或不顯色；若為陰性，酶標抗體正常結合，底物顯色深。
 
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 酶標儀；
③ 恒溫箱；
④ 微孔板快速振蕩器。
 
2、試劑和材料
① 陽性對照，EIV雞胚/細胞培養(yǎng)物、感染EIV的陽性組織樣品均可作為陽性對照；
② 陰性對照(PBS）；
③ 洗滌緩沖液PBST；
④ 封閉液；
⑤ 酶標抗體稀釋液；
⑥ TMB底物溶液(商品化試劑)；
⑦ 終止液；
⑧ EIV單克隆抗體包被板；
⑨ 酶標抗體。
 
 
三、實驗步驟
1、將拭子樣品充分捻動、擠干后，使用Pipetty電動移液器設置連續(xù)分液功能，每次吸取總量200μL樣品液加入抗體包被板，每份樣本加2個孔，每孔100μL。每塊包被板設陰性對照和陽性對照各2孔，每孔100μL。蓋好包被板，置37°C恒溫箱內(nèi)作用30 min。
 
2、棄去孔內(nèi)液體，每孔加入PBST 250μL。孵育3min,棄去PBST,重復洗滌4次，每次拍干。
3、使用Pipetty，用酶標抗體稀釋液將酶標抗體稀釋至工作度(1μg/mL),連續(xù)分液模式，每孔加100μL，置37°C作用30min，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入PBST 250μL,孵育3min,棄去PBST,重復洗滌4次，每次拍干。
4、每孔加新配制的TMB底物溶液100μL，在22℃(±2℃)下避光反應5min。
 
5、每孔加終止液50μL。輕微振蕩混合均勻后，置酶標儀中，在波長為450nm 下讀取OD值(OD),應在加入終止液后5min內(nèi)完成讀數(shù)。
 
 
四、結果判定
1、結果成立條件：陽性對照 OD_450nm>0.5;陰性對照OD_450nm≤0.1。
2、陽性：檢測樣品OD_40nm≥0.12時，判定為EIV抗原陽性。
3、陰性：待檢樣品OD450nm<0.12時，判定為EIV抗原陰性。