Pipetty電動(dòng)移液器在馬流感檢測(cè)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案使用Pipetty電動(dòng)移液器結(jié)合雞胚分離、MDCK細(xì)胞分離及血凝試驗(yàn)（HA試驗(yàn)），規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，提升移液精度與實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，保障馬流感檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為馬流感的快速篩查與病毒分離提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)參考。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

馬流感病毒（Equine Influenza Virus, EIV）可通過(guò)雞胚尿囊腔接種或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)分離增殖，增殖后的病毒能使雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)（血凝現(xiàn)象）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取樣品、試劑及病毒液，完成樣品處理、雞胚接種、細(xì)胞孵育及HA試驗(yàn)等關(guān)鍵步驟，利用血凝反應(yīng)判定病毒是否分離成功，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)馬流感的檢測(cè)。
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 恒溫培養(yǎng)箱；
③ 雞胚孵化器；
④ 恒溫水浴鍋；
⑤ 普通冰箱；
⑥ 超低溫冰箱；
⑦ 低溫離心機(jī)；
⑧ 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱；
⑨ 倒置顯微鏡；
⑩ 生物安全柜；
⑪ 酒精燈；
⑫ 鑷子。
 
2、試劑和材料
① 96孔V型或U型微量反應(yīng)板；
② 1mL注射器和5mL注射器；
③ 雙抗溶液(青霉素100000 IU/mL,鏈霉素1mg/mL)；
④ PBS；
⑤ 1%雞紅細(xì)胞懸液；
⑥ 10d~11d SPF 雞胚；
⑦ 2.5%胰蛋白酶儲(chǔ)存液(25ug/mL)；
⑧ 細(xì)胞培養(yǎng)皿；
⑨ MEM培養(yǎng)基；
⑩ MDCK細(xì)胞；
⑪ 碘酊或75%酒精；
⑫ 封口蠟。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將采集的馬流感拭子樣品充分捻動(dòng)、擠干后，用Pipetty電動(dòng)移液器取500μL樣品液至一新的離心管中，再加入等量雙抗溶液，輕輕混勻。將離心管置于低溫離心機(jī)中，以3000r/min、4℃條件離心10 min，離心結(jié)束后，用Pipetty吸取上清液，用于后續(xù)SPF雞胚或MDCK細(xì)胞接種，未用完的樣品置于-70℃以下超低溫冰箱保存。
2、SPF雞胚分離
① 將孵化至10d~11d的SPF雞胚氣室部位蛋殼用碘酊或75%酒精消毒后，在氣室部位蛋殼上打一個(gè)小孔，用于接種樣品；
  ② 每份樣品接種3枚雞胚，每枚胚尿囊腔接種0.2mL；
 
③ 用封口蠟封孔，雞胚置35℃孵化器內(nèi)孵化，移去24h內(nèi)死亡的胚，其余雞胚繼續(xù)孵化至72h；
④ 接種后72h,將雞胚轉(zhuǎn)到2℃~8℃中放置4h或過(guò)夜；
  ⑤ 取出雞胚，先將蛋殼表面消毒，用鑷子敲碎并剝離氣室蛋殼，然后挑破殼膜和絨毛尿囊膜，用注射器等適宜材料收獲尿囊液，取適量進(jìn)行血凝試驗(yàn)；
  ⑥ 每胚收獲的尿囊液分別標(biāo)記并于-70℃保存。
3、 MDCK細(xì)胞分離
   ① MDCK細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)成單層后，用含2μg/mL胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)液(無(wú)血清)至少洗滌2次；
 ② 使用Pipetty，培養(yǎng)皿每孔加入0.25mL樣品，每個(gè)樣品加3個(gè)孔，置37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h；
 ③ 培養(yǎng)皿每孔加入含0.5 μg/mL胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)基，置37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
   ④ 每天在顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞病變情況；
⑤ 當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓、聚團(tuán)和崩解(CPE)時(shí)，可收集上清液。如無(wú)CPE，則7d后收集上清液，進(jìn)行血凝試驗(yàn)；
⑥ 上清液保存于-70℃。
4、 HA試驗(yàn)
① 使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，在96孔微量反應(yīng)板每孔等量加入25μLPBS；
② 每行第1孔中，用Pipetty單次模式加入上述雞胚尿囊液或MDCK細(xì)胞上清液（病毒分離液）25μL，按UP鍵自動(dòng)混勻；隨后從第1孔吸出25μL液體加于第2孔，混勻后吸出25μL液體加于第3孔，如此進(jìn)行2倍倍比稀釋至第11孔，第11孔棄去25μL液體；第12孔不加抗原，僅加PBS緩沖液，作為陰性對(duì)照；
 
③ 每孔中再加25μLuLPBS；
④ 每孔加50μL 1%紅細(xì)胞懸液，22°C(±2℃)作用30 min，觀察HA結(jié)果。
5、判定方法
① 當(dāng)雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)時(shí),其均勻分布在微量反應(yīng)板底部，將微量反應(yīng)板傾斜45°角20s~30s,紅細(xì)胞不下滑，即HA陽(yáng)性；
② 紅細(xì)胞未出現(xiàn)凝集時(shí)，微量反應(yīng)板傾斜后，可見(jiàn)沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，形成流線或淚滴狀，即HA陰性。
③ 樣品的HA效價(jià)為全部雞紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集時(shí)的最高稀釋倍數(shù)。
④ 陽(yáng)性的樣品作小量等份(每份1mL)分裝,并取其1份測(cè)定HA效價(jià),其余樣品置一70℃以下保存。 HA陰性的樣品尿囊液(或細(xì)胞上清)收集在一起，再經(jīng)雞胚或MDCK細(xì)胞盲傳，最多進(jìn)行5次盲傳。如傳至第五代仍無(wú)血凝活性，可放棄分離病毒。
 
 
四、結(jié)果判定
1、 結(jié)果成立條件：HA試驗(yàn)中，雞紅細(xì)胞對(duì)照孔不發(fā)生凝集，微量反應(yīng)板傾斜后，可見(jiàn)沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，形成流線或淚滴狀。
2、HA陽(yáng)性，判定為EIV分離陽(yáng)性。
3、HA陰性，判定為EIV分離陰性。