電生理檢測助力可抑制心臟傳導(dǎo)的新型鈉通道Nav1.5抑制劑的篩選鑒定

簡介：
電壓門控鈉通道（Navs）含多種亞型，其中Nav1.5是心臟主要鈉通道亞型，對維持心臟正常電活動至關(guān)重要，是Ⅰ類抗心律失常藥物的經(jīng)典治療靶點(diǎn)，其相關(guān)基因突變與長QT綜合征、房顫等多種心臟疾病相關(guān)。傳統(tǒng)Nav1.5抑制劑（如奎尼丁、氟卡尼等）存在亞型選擇性差、副作用明顯、部分特殊患者（如腎功能不全者、關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)突變者）治療受限等問題。

基于此，浙江大學(xué)藥學(xué)院侯廷軍教授課題組在Acta Pharmacologica Sinica雜志發(fā)表題為“Discovery of a novel Nav1.5 inhibitor reducing cardiac conduction via structure-based virtual screening and assays”的研究論文。

本文旨在通過整合基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選、分子動力學(xué)模擬、結(jié)構(gòu)優(yōu)化、膜片鉗及電標(biāo)測等技術(shù)，篩選并鑒定新型高效的Nav1.5抑制劑，探究其結(jié)合機(jī)制與對心臟傳導(dǎo)的調(diào)控作用，為解決傳統(tǒng)抗心律失常藥物存在的亞型選擇性差、副作用明顯等問題提供新方案，進(jìn)而為靶向 Nav1.5的抗心律失常藥物研發(fā)提供有價(jià)值的候選化合物與參考依據(jù)。

結(jié)論：
本研究整合計(jì)算分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，證實(shí)化合物KH2是一種新型Nav1.5抑制劑，可特異性靶向中央腔結(jié)合口袋。通過電生理檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，KH2能夠降低心房與心室的傳導(dǎo)速度，進(jìn)而改變心肌的除極與復(fù)極過程。上述研究結(jié)果為后續(xù)構(gòu)效關(guān)系研究及類似物設(shè)計(jì)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，可為藥物優(yōu)化工作提供支撐。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)構(gòu)全新的Nav1.5抑制劑，為抗心律失常藥物的靶向研發(fā)提供了重要參考。

研究結(jié)果：

1. KH2作為新型鈉通道Nav1.5抑制劑的鑒定
本研究采用整合性藥物發(fā)現(xiàn)策略，經(jīng)大規(guī)�；�合物篩選得到Nav1.5抑制劑KH1，再通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化獲得衍生物KH2。KH2對Nav1.5的抑制活性優(yōu)于KH1，且對Nav1.5的選擇性顯著高于其他Nav亞型，是一種結(jié)構(gòu)新穎的強(qiáng)效抑制劑。

圖1. 本研究采用了整合性藥物發(fā)現(xiàn)策略

圖2. KH2的抑制活性與亞型選擇性

本研究結(jié)合計(jì)算生物學(xué)技術(shù)與定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，探究KH2與Nav1.5中央腔結(jié)合口袋的結(jié)合穩(wěn)定性及作用機(jī)制。經(jīng)IFD對接、多重復(fù)MD模擬及結(jié)合能計(jì)算，證實(shí)KH2可在口袋內(nèi)穩(wěn)定結(jié)合，且以疏水作用為主。單點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明C896、L931、F1760等殘基對KH2結(jié)合至關(guān)重要，T1417影響通道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；多位點(diǎn)突變驗(yàn)證了關(guān)鍵殘基的協(xié)同效應(yīng)。綜上，KH2主要通過與特定疏水氨基酸殘基相互作用，穩(wěn)定結(jié)合于Nav1.5的中央腔結(jié)合口袋。

圖3. 分子動力學(xué)模擬與定點(diǎn)突變技術(shù)，預(yù)測了KH2在中央腔結(jié)合口袋中的結(jié)合構(gòu)象

3. KH2可降低心臟傳導(dǎo)功能
本研究采用電標(biāo)測技術(shù)探究KH2對離體大鼠心臟的作用，將電極置于左心房與左心室監(jiān)測電活動。結(jié)果顯示，低濃度KH2可一過性升高心率、降低心房傳導(dǎo)速度且不改變傳導(dǎo)方向；高濃度KH2顯著延長有效不應(yīng)期及PR、QRS、QT間期，抑制心室傳導(dǎo)速度，但對房室延遲無影響，其作用與阻滯鈉通道、調(diào)控心肌除極復(fù)極過程相關(guān)。此外，KH2對hERG電流的抑制活性遠(yuǎn)低于Nav1.5，對Kir2.1電流無顯著抑制，且超治療劑量下無急性全身及神經(jīng)行為毒性。綜上，KH2有望為治療傳導(dǎo)異常性心律失常提供潛在方案。

圖4. KH2降低離體大鼠心臟左心房傳導(dǎo)速度

4. KH2表現(xiàn)出獨(dú)特的結(jié)合機(jī)制
本研究對比KH2與奎尼丁等三種抗心律失常藥結(jié)合Nav1.5的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)它們均結(jié)合于Nav1.5中央腔口袋，且均受F1760殘基影響。但KH2的結(jié)合位置、構(gòu)象與傳統(tǒng)藥物不同，傳統(tǒng)藥物靠極性作用結(jié)合，KH2則通過非共價(jià)作用穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制均具獨(dú)特性。

圖5. KH2與部分已知抑制劑在中央腔結(jié)合口袋的結(jié)合構(gòu)象比較

本文應(yīng)用多通道電生理標(biāo)測技術(shù)對不同組大鼠心臟電生理信號進(jìn)行標(biāo)測，結(jié)果證明低濃度KH2可一過性升高心率、降低心房傳導(dǎo)速度且不改變傳導(dǎo)方向；高濃度KH2顯著延長有效不應(yīng)期及PR、QRS、QT 間期，抑制心室傳導(dǎo)速度，但對房室延遲無影響，其作用與阻滯鈉通道、調(diào)控心肌除極復(fù)極過程相關(guān)。