Pipetty電動移液器在犬細小病毒檢測（HI實驗）中的應用

方案摘要：犬細小病毒 HI 實驗是檢測犬血清中 CPV 特異性抗體的經(jīng)典血清學方法，核心用于評估犬只免疫狀態(tài)、追溯既往感染，不直接檢測病毒抗原。為提升實驗效率，實驗采用了Pipetty電動移液器，這款移液器擁有輕便小巧的特點，重量僅 75g，操作起來十分舒適。同時，它具備高精度的等量連續(xù)分液能力，能夠按照設定的移液量進行多次重復排液，并且配備了溫度控制功能，可避免因手部熱量影響而導致的精度降低。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       犬細小病毒 HI 實驗核心基于犬細小病毒（CPV）的血凝特性與特異性抗體的抑制作用，用于檢測血清中 CPV 特異性抗體。首先，CPV（尤其 CPV-2 型及變異株）可特異性結(jié)合豬紅細胞表面受體，使紅細胞脫離懸浮狀態(tài)、聚集成團，形成肉眼可見的絮狀沉淀，此為 “血凝反應”。若待檢血清中存在 CPV 特異性抗體，抗體將優(yōu)先與 CPV 結(jié)合形成抗原 - 抗體復合物，占據(jù) CPV 上能結(jié)合紅細胞的位點，從而阻斷 CPV 與紅細胞的相互作用，抑制血凝反應發(fā)生。實驗中通過對血清進行倍比稀釋，觀察不同稀釋度下是否出現(xiàn)血凝抑制，可確定 “完全抑制血凝的最高血清稀釋度”，即 CPV 抗體滴度，以此量化血清中 CPV 抗體的水平。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 冰箱（4 ℃、20 ℃、-70 ℃）；
③ 恒溫培養(yǎng)箱（5℃~100℃）；
④ 微型混合器；
⑤ 96孔V形微量反應板。
 
2、試劑和材料
① PBS；
② 1%豬紅細胞懸液；
③ CPV標準陽性血清。
 
三、實驗步驟
1、根據(jù)測定好的病毒血凝效價，配制4個血凝單位（4HAU）病毒液。若血凝的終點滴度為1:256，則4HAU=256/4=64（即1:64），即通過1:64稀釋獲得4HAU病毒液。
2、使用Pipetty電動移液器，設置M連續(xù)分液模式，在96孔V形微量反應板上，第1孔~第11孔中各加入25μLPBS。在第12孔加入50μL PBS作為紅細胞對照。
 
3、使用單次分液模式，取25μL CPV陽性血清加入左側(cè)第1孔，按UP鍵進入混勻模式，自動混勻后，吸出25μL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，從第10孔中吸出25μL棄掉。
 
4、使用M連續(xù)分液模式，在第1孔~第11孔中加入配制好的4HAU病毒液 25μL，置于微型混合器上振蕩10s，混合均勻，在37℃條件下靜置60min。第11孔作為4HAU病毒液對照。
5、使用M連續(xù)分液模式，由左至右依次向每孔加入25μL 1%豬紅細胞懸液，置于微型混合器上振蕩10s，混合均勻，在4℃條件下靜置30min~60min，待第11孔4HAU病毒液對照孔出現(xiàn)紅細胞100%凝集時可觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判定
將96孔V形微量反應板傾斜，觀察4HAU病毒液血凝性是否被CPV陽性血清特異性抑制，紅細胞有無淚珠狀流淌。當4HAU病毒液對照孔紅細胞完全凝集，PBS對照孔紅細胞呈現(xiàn)淚珠狀流淌，則試驗成立。能被CPV陽性血清抑制血凝者，判為CPV陽性；不能被CPV陽性血清抑制血凝者，判為CPV陰性。