冷晶體停搏液聯(lián)合保存液上調(diào)NR4A3借代謝重編程提升供心保護(hù)研究

4. 單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq）顯示，在經(jīng)CC+UW處理的心肌細(xì)胞中NR4A3基因表達(dá)上調(diào)
為探究調(diào)控NFκB相關(guān)炎癥通路的分子，進(jìn)行snRNA-seq，將細(xì)胞分八類，心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞占多數(shù)。提取心肌細(xì)胞細(xì)胞核進(jìn)行PCA發(fā)現(xiàn)兩組轉(zhuǎn)錄有差異，CC+UW組NR4A3在各時(shí)間點(diǎn)上調(diào)最顯著且被驗(yàn)證，該組NR4A3陽(yáng)性細(xì)胞比例高且激活，UW組幾乎無(wú)活性。二次聚類分十個(gè)心肌細(xì)胞組，部分組NR4A3上調(diào)并定義為高表達(dá)細(xì)胞。分析顯示NR4A3hi_car細(xì)胞分化程度高，部分基因表達(dá)與NR4A3lo_car細(xì)胞有差異，XIAP 高表達(dá)。細(xì)胞通訊和基因關(guān)聯(lián)分析表明，NR4A3hi_car細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用強(qiáng)，NR4A3lo_car細(xì)胞促炎基因表達(dá)高，CC+UW組 NR4A3上調(diào)或重塑轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)、抑制炎癥、增強(qiáng)心肌功能。

圖4 snRNA-seq揭示了左心室組織的細(xì)胞圖譜，并確定NR4A3為一個(gè)關(guān)鍵基因

5. SCS過(guò)程中，NR4A3過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制雙特異性磷酸酶2（DUSP2）降低NFκB - p65（Ser529）的磷酸化水平 
研究了NR4A3對(duì)小鼠心臟在SCS條件下的影響及其作用機(jī)制。通過(guò)尾靜脈注射過(guò)表達(dá)NR4A3的腺相關(guān)病毒，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NR4A3可減輕SCS誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷，表現(xiàn)為左心室射血分?jǐn)?shù)提高、ROS積累減少、細(xì)胞凋亡減少以及心肌損傷生物標(biāo)志物（LDH、LDH1、CK、CK-MB）血清濃度降低。Western blot表明NR4A3可抑制p65（Ser529）的磷酸化。RNA測(cè)序和CUT&Tag分析發(fā)現(xiàn)NR4A3過(guò)表達(dá)影響的基因在細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路中富集，且確定了與NR4A3相關(guān)的基因，其中DUSP2可激活NFκB通路且其啟動(dòng)子與 NR4A3結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NR4A3過(guò)表達(dá)可降低DUSP2蛋白水平，抑制DUSP2可降低 p65（Ser529）磷酸化水平、減少心肌細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生。綜上，NR4A3可能通過(guò)抑制DUSP2轉(zhuǎn)錄，降低p65磷酸化水平，減輕SCS對(duì)小鼠心臟的損傷。

圖5 SCS期間NR4A3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠心臟NFκB通路的影響

6. CC+UW可改善Langendorff灌注大鼠心室壓、電傳導(dǎo)和心律
在Langendorff灌流的大鼠心臟進(jìn)行電標(biāo)測(cè)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證CC+UW處理方法的效果。研究發(fā)現(xiàn)，CC+UW-8h組動(dòng)脈波相似。在計(jì)算左室收縮期末峰值壓和左室舒張末期峰值壓后，發(fā)現(xiàn)CC+UW組在8h的脈壓變化大于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，CC+UW可恢復(fù)大鼠心臟射血功能。

在電傳導(dǎo)方面，對(duì)照組和CC+UW-8h組呈現(xiàn)相似的等時(shí)圖和離散圖，與UW處理8小時(shí)組相比左心室電傳導(dǎo)性更強(qiáng)、傳導(dǎo)速度更快。其傳導(dǎo)離散程度和竇性心律恢復(fù)時(shí)間與對(duì)照組相當(dāng)，UW處理8小時(shí)組則顯著增加。

心電圖評(píng)估顯示，CC+UW處理8小時(shí)組波形與對(duì)照組相似，心率略低，QRS和QT時(shí)間間隔短但因靜態(tài)冷保存較對(duì)照組有所延長(zhǎng)，三組心室有效不應(yīng)期相當(dāng)。

綜上，CC+UW處理方法可增強(qiáng)電傳導(dǎo)和心室射血、減少心律失常并提高心臟移植存活率。

圖6 CC+UW對(duì)大鼠電生理標(biāo)測(cè)指標(biāo)的影響

7. CC+UW使得長(zhǎng)時(shí)間冷缺血的供體心臟能夠被使用，并提高心臟移植后的中期生存率
利用臨床隊(duì)列對(duì)比了武漢協(xié)和醫(yī)院使用的CC+UW保存方法和UNOS數(shù)據(jù)庫(kù)中UW保存液的效果。納入360名CC+UW受者和13164名UW受者，發(fā)現(xiàn)CC+UW組供者冷缺血時(shí)間更長(zhǎng)，兩組總體生存率相當(dāng)。多因素Cox回歸分析表明，隨著冷缺血時(shí)間增加風(fēng)險(xiǎn)比上升，且CC+UW組冷缺血時(shí)間超過(guò)5.8小時(shí)風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，而UW組超過(guò)3.3小時(shí)風(fēng)險(xiǎn)較高。KM生存分析顯示，UW組冷缺血時(shí)間≥6小時(shí)的供者生存率優(yōu)于<6小時(shí)的供者，CC+UW組兩組無(wú)顯著差異，且CC+UW 可擴(kuò)大長(zhǎng)時(shí)間冷缺血供者來(lái)源。因兩組存在差異難以進(jìn)行傾向得分匹配（PSM），利用美國(guó)器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（UNOS）數(shù)據(jù)庫(kù)中281名CC+UW供者進(jìn)行PSM匹配后發(fā)現(xiàn)，CC+UW組生存率顯著高于UW組，多因素Cox回歸分析顯示，使用UW保存液也是影響中期生存的一個(gè)危險(xiǎn)因素，并且會(huì)對(duì)供體風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（DRI）和IMAPCT評(píng)分產(chǎn)生影響。

圖7 CC+UW可延長(zhǎng)冷缺血時(shí)間供體的使用，并提高心臟移植后的中期生存率。研究納入了美國(guó)器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（UNOS）2005至2021年成年心臟移植受者數(shù)據(jù)，以及武漢協(xié)和醫(yī)院2019至 2023年心臟移植隊(duì)列

結(jié)論：
研究證實(shí)CC聯(lián)合UW法是一種高效的供體心臟獲取與保存策略。該方法既能減少能量損耗又能緩解炎癥反應(yīng)，極具發(fā)展?jié)摿�。有望成為拓寬心臟移植適用標(biāo)準(zhǔn)、緩解供體心臟短缺困境的實(shí)用技術(shù)，為心臟移植領(lǐng)域帶來(lái)新的突破。