MEA-seqX在解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)跨尺度動力學(xué)中的應(yīng)用

圖 1｜MEA-seqX 跨尺度神經(jīng)研究框。

MEA-seqX 在同一腦組織樣本中整合 3Barin 高分辨率微電極陣列電生理記錄、空間轉(zhuǎn)錄組測序和組織成像數(shù)據(jù) (a–d)。通過空間配準(zhǔn)將不同模態(tài)數(shù)據(jù)映射到統(tǒng)一的組織坐標(biāo)系中 (e)，并進一步通過多模態(tài)計算分析解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及細(xì)胞類型特征 (g)，從而建立神經(jīng)活動與基因表達(dá)之間的跨尺度關(guān)聯(lián)。

3Brain HD-MEA 記錄海馬–皮層腦片多區(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動
研究團隊利用 3Brain 高分辨率微電極陣列平臺對小鼠海馬–皮層急性腦片進行大規(guī)模神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理記錄，并行采集來自齒狀回 (DG)、Hilus、CA3、CA1以及內(nèi)嗅皮層 (EC) 等多個腦區(qū)的神經(jīng)活動信號（圖1a），構(gòu)建具有空間坐標(biāo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動圖譜。隨后，研究者從局部場電位LFP信號中提取多種網(wǎng)絡(luò)活動特征，包括LFP 振幅 (amplitude)、事件頻率 (rate)、信號傳播延遲 (delay) 以及振蕩能量 (energy)，用于描述海馬網(wǎng)絡(luò)的整體活動模式（圖2a）。

研究團隊隨后將這些電生理特征與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在齒狀回和 CA3 等關(guān)鍵海馬區(qū)域，多種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動指標(biāo)與局部基因表達(dá)模式之間存在顯著空間關(guān)聯(lián)（圖2a）。在豐富環(huán)境 (enriched environment) 條件下，LFP 振幅和事件頻率等指標(biāo)與基因表達(dá)之間的對應(yīng)關(guān)系進一步增強，說明環(huán)境經(jīng)驗?zāi)軌蛲瑫r影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與分子表達(dá)狀態(tài)（圖2a）。

除了量化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動強度，研究團隊還對記錄到的 LFP 波形形態(tài)進行分類。通過主成分分析結(jié)合聚類算法，研究者識別出不同海馬層級中具有區(qū)域特征的振蕩波形模式（圖2b），揭示海馬網(wǎng)絡(luò)在空間上呈現(xiàn)出明顯的功能分層。

研究者進一步在網(wǎng)絡(luò)連接層面 (network connectivity) 分析電極之間的活動相關(guān)性 (pairwise firing correlation)，并據(jù)此構(gòu)建海馬網(wǎng)絡(luò)的功能連接圖譜。結(jié)果顯示，在豐富環(huán)境條件下，海馬網(wǎng)絡(luò)的連接強度明顯增強，跨區(qū)域神經(jīng)活動同步程度更高（圖2c）�；�于 LFP 信號構(gòu)建的相關(guān)矩陣也呈現(xiàn)出類似趨勢，提示豐富環(huán)境條件下海馬網(wǎng)絡(luò)整體振蕩的協(xié)調(diào)性明顯提升（圖2d）。

在此基礎(chǔ)上，研究者進一步從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (network topology) 的角度分析海馬網(wǎng)絡(luò)。通過圖論分析方法 (graph-theoretic analysis)，研究者識別出網(wǎng)絡(luò)中的高度連接節(jié)點 (hub nodes) 以及由這些節(jié)點組成的“富集俱樂部” (rich-club) 結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，在環(huán)境豐富化條件下，海馬網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)更多高度連接的樞紐節(jié)點，并形成更明顯的rich-club 組織，表明不同海馬區(qū)域之間建立了更緊密的功能連接（圖2e）。
 

圖 2｜3Brain 高分辨率解析小鼠海馬體-皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動

(a) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與基因表達(dá)之間的空間關(guān)聯(lián)。橫軸表示不同的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動特征（如 LFP 振幅、事件頻率、傳播延遲等），縱軸表示在空間轉(zhuǎn)錄組測序位點中 (SRT spot)，與這些電生理特征顯著相關(guān)的基因表達(dá)模式數(shù)量�；疑�表示標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，藍(lán)色表示豐富環(huán)境條件 (ENR)。柱狀體越高，說明該網(wǎng)絡(luò)活動特征與更多基因表達(dá)存在空間關(guān)聯(lián)。

(b) 不同海馬區(qū)域的LFP波形模式�；疑�曲線表示檢測到的LFP振蕩事件的單次波形，彩色曲線表示該類事件的平均波形。橫軸為時間 (ms)，縱軸為電壓幅度 (µV)。

(c) 神經(jīng)元共放電構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)連接圖。矩陣中的每個方格表示成對放電電極之間神經(jīng)元放電spike活動的相關(guān)性 (Pearson correlation coefficient, PCC)。顏色越深表示電極之間成對放電活動 (pairwise firing) 的相關(guān)性越高，反映更強的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接。

(d) 海馬不同腦區(qū)之間的 LFP 活動相關(guān)性。柱狀圖展示不同腦區(qū)對之間LFP 信號的相關(guān)性 (PCC)。柱狀體越高表示兩個腦區(qū)之間的神經(jīng)活動同步性越強。

(e) 海馬網(wǎng)絡(luò)連接的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。圖中每個節(jié)點代表一個神經(jīng)活動記錄位置，連線表示兩個節(jié)點之間存在顯著的神經(jīng)活動相關(guān)性。為便于展示整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，僅顯示約 2% 的連接關(guān)系（SD：node = 1057，links = 24217；ENR：node = 2003，links = 36312）。節(jié)點大小根據(jù)其連接度 (degree) 進行縮放，即該節(jié)點與其他節(jié)點建立連接的數(shù)量；節(jié)點越大表示其與更多節(jié)點存在功能連接。不同顏色表示節(jié)點所屬的海馬區(qū)域，彩色連線表示區(qū)域內(nèi)或區(qū)域之間的功能連接。中間的圓形圖展示網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點結(jié)構(gòu)，其中 hub nodes 表示具有較高連接度的節(jié)點，rich-club 表示這些高連接節(jié)點之間形成的高度互聯(lián)結(jié)構(gòu)。左側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，右側(cè)為豐富環(huán)境 (ENR)。

機器學(xué)習(xí)進一步解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)
在使用 3Brain HD-MEA 獲得大規(guī)模電生理數(shù)據(jù)后，研究團隊進一步通過計算分析與機器學(xué)習(xí)方法解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的多尺度結(jié)構(gòu)。首先，研究者采用非負(fù)矩陣分解 (Non-negative Matrix Factorization, NMF) 將復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)活動拆解為多個具有特定空間分布和時間特征的網(wǎng)絡(luò)模塊 (network modules)，從而識別不同海馬亞區(qū)之間的功能子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3a）。

在此基礎(chǔ)上，研究者進一步分析神經(jīng)活動在腦片中的傳播動態(tài)。通過計算神經(jīng)活動傳播軌跡中心 (center of activity trajectory, CAT)，可以追蹤神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動在不同海馬區(qū)域之間的傳播方向，從而描繪海馬網(wǎng)絡(luò)中的信息傳播路徑（圖3b）。

隨后，研究團隊利用機器學(xué)習(xí)算法 XGBoost (Chen & Guestrin, 2016) 探索基因表達(dá)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動之間的預(yù)測關(guān)系。模型根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測多個關(guān)鍵電生理指標(biāo)，例如LFP 事件頻率、振幅以及信號傳播延遲（原文附圖8）。預(yù)測結(jié)果與實際電生理測量值之間表現(xiàn)出較高一致性 (Pearson r ≈ 0.9)，說明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動特征在很大程度上可以由基因表達(dá)模式進行預(yù)測。

圖 3｜機器學(xué)習(xí)解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)

(a) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與基因表達(dá)之間的空間關(guān)聯(lián)分布。圖中展示在不同海馬區(qū)域中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動特征 (LFP 事件頻率) 與多種神經(jīng)功能相關(guān)基因表達(dá)之間的對應(yīng)關(guān)系。每一列代表一個基因，每一行代表一個空間位置。顏色越深，表示該位置的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與該基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)越強。上圖為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件 (SD)，下圖為豐富環(huán)境條件 (ENR)。

(b) 非負(fù)矩陣分解識別的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)–基因表達(dá)關(guān)聯(lián)模塊。研究者利用非負(fù)矩陣分解 (NMF) 將復(fù)雜的電生理特征與基因表達(dá)數(shù)據(jù)拆解為多個潛在因子 (NMF factors)。圖中每個小圖對應(yīng)一個因子，曲線表示該因子在不同網(wǎng)絡(luò)活動特征中的貢獻權(quán)重。不同顏色表示該因子中貢獻最大的代表基因。

3D HD-MEA腦片電生理與多模態(tài)分析實驗流程
為系統(tǒng)研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與基因表達(dá)之間的關(guān)系，研究團隊結(jié)合 3Brain HD-MEA 電生理記錄與空間轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建跨尺度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能圖譜。整體實驗流程如下 (具體 workflow 詳見原文附圖 1）。

01. 腦片制備與接種
小鼠海馬–皮層急性腦片（厚度約 300 μm）在氧合的人工腦脊液中制備，并在 34 °C 條件下孵育約 45 分鐘恢復(fù)組織活性，隨后在室溫下繼續(xù)恢復(fù)至少1 小時后用于電生理記錄。記錄過程中持續(xù)灌流氧合的記錄液（95% O₂ / 5% CO₂），以維持穩(wěn)定的離子環(huán)境和組織活性。

在記錄過程中，腦片通過鉑金固定框 (platinum harp) 穩(wěn)定放置于 3Brain 高分辨率微電極陣列芯片表面，并在恒溫灌流系統(tǒng)中進行記錄。灌流速率約為4.5 mL min⁻¹，記錄溫度維持在 37 °C，以保證腦片在長時間實驗過程中的穩(wěn)定性。

02. HD‑MEA 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理數(shù)據(jù)采集
在該系統(tǒng)中，芯片集成的放大電路提供 0.1–5 kHz 帶通濾波，并具有 60 dB 的全局增益 (global gain)，可同時記錄慢速與快速神經(jīng)振蕩信號。細(xì)胞外電信號以 14 kHz / 電極的采樣率進行采集，每次實驗持續(xù)10 分鐘，連續(xù)記錄腦片中的細(xì)胞外電活動。

基于這些連續(xù)記錄的數(shù)據(jù)，研究者以 1 Hz 的時間分辨率提取神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動事件，即按每秒一次的時間尺度對網(wǎng)絡(luò)活動進行統(tǒng)計與分析。為增強網(wǎng)絡(luò)活動的興奮強度，在記錄液中加入100 μM 4AP以誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動。

此外，系統(tǒng)集成了一套定制模塊化立體顯微鏡，在電生理記錄后對同一腦片進行光學(xué)成像。隨后通過 3Brain 配套軟件 BrainWave 將圖像與電極陣列數(shù)據(jù)進行疊加 (merge)，從而建立腦片組織結(jié)構(gòu)與 HD-MEA 電極布局之間的空間對應(yīng)關(guān)系，實現(xiàn)神經(jīng)活動與腦區(qū)結(jié)構(gòu)的精確對齊。

03. 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩信號提取與波形分類
獲得原始電生理信號后，研究者首先從寬帶細(xì)胞外記錄中提取局部場電位LFP。隨后通過硬閾值檢測算法 (hard threshold algorithm) 識別網(wǎng)絡(luò)振蕩事件，并使用四階Butterworth 低通濾波器（一種常見的信號處理方法，用于保留低頻信號并去除高頻噪聲）在 1–100 Hz 頻段對信號進行濾波，以提取反映神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)群體活動的 LFP 振蕩信號。在此基礎(chǔ)上，對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動的多個特征進行量化分析，包括LFP 事件發(fā)生頻率、振蕩振幅、振蕩能量、神經(jīng)信號傳播延遲以及振蕩峰值數(shù)量，用于描述海馬網(wǎng)絡(luò)在不同空間位置的活動模式。

為了進一步比較不同腦區(qū)之間的振蕩特征，研究者對記錄到的 LFP 波形進行模式分類分析。具體而言，通過主成分分析 (principal component analysis, PCA) 提取波形的主要特征，再結(jié)合 K-means 聚類算法對振蕩波形進行分組，從而識別不同海馬結(jié)構(gòu)層級中具有代表性的振蕩模式及其空間分布。

04. 電生理特征與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合分析
為分析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動與基因表達(dá)模式之間的關(guān)系，研究者將提取的電生理網(wǎng)絡(luò)特征與同一腦片獲得的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行整合分析。首先，通過 Spearman 相關(guān)分析評估不同空間位置的基因表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動特征之間的關(guān)聯(lián)程度，以量化轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜系與電生理活動之間的空間對應(yīng)關(guān)系。

在此基礎(chǔ)上，進一步利用 XGBoost 機器學(xué)習(xí)模型對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理特征進行預(yù)測分析 (Chen & Guestrin, 2016)。模型以約 70% 的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，用于學(xué)習(xí)基因表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動之間的關(guān)系，并以剩余數(shù)據(jù)進行預(yù)測評估。預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)活動指標(biāo)包括LFP事件頻率、振蕩振幅以及神經(jīng)信號傳播延遲等特征，用于分析轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)之間的多尺度關(guān)聯(lián)。