電生理學(xué)檢測助力揭示乳腺癌獨立致心律失常新機制

心房顫動是臨床最常見的難治性心律失常，可顯著增加患者卒中、心衰風(fēng)險及全因死亡率。已有研究證實，乳腺癌會顯著增加房顫發(fā)生率并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。但相關(guān)研究均聚焦于抗腫瘤治療所致的心房損傷，未探究腫瘤分泌因子是否能獨立于治療手段，直接誘發(fā)心房重構(gòu)和房顫。腫瘤分泌蛋白是調(diào)控微環(huán)境的核心介質(zhì)，而當(dāng)前針對未接受抗腫瘤治療的乳腺癌患者，其心房病理特征與房顫患病情況的研究仍較為匱乏，這一科學(xué)問題亟待深入探究。

基于此，大連醫(yī)科大學(xué)楊曉蕾教授、夏云龍教授團隊聯(lián)合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉教授團隊在European Heart Journal(IF 35.6)雜志發(fā)表題為“Breast tumour-secreted ADAM10 mediates atrial fibrogenesis and fibrillation”的研究論文。

一、臨床研究方法
建立未接受抗腫瘤治療的乳腺癌患者與健康對照隊列，奠定臨床關(guān)聯(lián)基礎(chǔ)。通過心電圖、動態(tài)心電圖開展核心電生理學(xué)篩查，明確患者房顫發(fā)生情況及心房電活動異常特征，同時采用蛋白質(zhì)印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿及腫瘤組織中關(guān)鍵蛋白表達，借助傾向性評分匹配及回歸模型完成臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)驗證。

二、動物實驗方法
以C57BL/6J小鼠為研究對象，構(gòu)建原位乳腺癌、腫瘤條件培養(yǎng)基/血漿處理、基因敲低及藥物抑制等多種模型，電生理學(xué)檢測為核心評估手段：

記錄小鼠體表心電圖，分析P波、PR間期等心房電生理指標(biāo)；通過程序性電刺激評估房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間；運用高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)精準(zhǔn)檢測左右心房傳導(dǎo)速度，量化心房電重構(gòu)特征，為房顫易感性評估提供核心依據(jù)。

采用Masson三色染色觀察心房纖維化程度，通過蛋白質(zhì)印跡法、實時熒光定量PCR檢測心房組織中纖維化標(biāo)志物及通路相關(guān)基因、蛋白表達，結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿中關(guān)鍵蛋白水平，同步監(jiān)測腫瘤生長情況，為電生理學(xué)結(jié)果提供機制支撐。

三、細胞實驗方法
構(gòu)建乳腺癌細胞與心房成纖維細胞的Transwell共培養(yǎng)模型，結(jié)合基因敲低、重組蛋白處理等方式干預(yù)關(guān)鍵靶點。通過免疫熒光染色驗證纖維化相關(guān)蛋白表達，采用BrdU標(biāo)記、細胞遷移實驗評估心房成纖維細胞功能，借助蛋白質(zhì)印跡法、實時熒光定量PCR檢測通路相關(guān)分子表達，明確細胞層面的作用機制，為動物實驗中的電生理學(xué)現(xiàn)象提供細胞水平解釋。

四、蛋白質(zhì)組學(xué)分析
對健康對照、乳腺癌合并/不合并房顫患者及小鼠的血漿樣本進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選跨物種的差異表達蛋白，鎖定sADAM10作為核心研究靶點，為后續(xù)電生理學(xué)檢測及機制驗證提供明確方向。

研究結(jié)果：
1. 治療前乳腺癌（PTBC）患者心房顫動（AF）患病率顯著更高
經(jīng)傾向性評分匹配后，PTBC患者的房顫發(fā)生風(fēng)險遠高于健康對照組，患者血漿sADAM10水平與心房重構(gòu)標(biāo)志物PTFV1呈顯著正相關(guān)，且不同乳腺癌亞型間無顯著差異，同時患者存在更明顯的心房重構(gòu)，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn) PTBC患者與健康對照間存在多個差異表達蛋白。

圖1 治療前乳腺癌患者心房顫動患病率更高

2. 乳腺癌增加同源腫瘤移植小鼠模型的房顫易感性
通過構(gòu)建乳腺癌小鼠模型，檢測發(fā)現(xiàn)模型組小鼠出現(xiàn)雙峰P波、P波波寬延長、PR間期延長、心率減慢，自發(fā)性房性心律失常誘發(fā)率升高等電生理改變，給予程序性電刺激后房顫的誘發(fā)率及持續(xù)時間均顯著高于對照組，模型組小鼠心房傳導(dǎo)速度降低。此外，其心房纖維化面積增大，心房組織中Ⅰ型膠原（Col-1）、Ⅲ型膠原（Col-3）等纖維化標(biāo)志物的蛋白及mRNA水平均顯著上調(diào)。

圖2 乳腺癌增加同源腫瘤移植小鼠模型的房顫易感性

3. 腫瘤條件培養(yǎng)基及腫瘤血漿可誘導(dǎo)房顫相關(guān)病理改變
給小鼠尾靜脈注射E0771細胞的腫瘤條件培養(yǎng)基（TCM）或乳腺癌小鼠的血漿（TP）后，證實小鼠房顫易感性增加，心房電生理異常，傳導(dǎo)速度降低，心房纖維化加重；體外實驗中，E0771乳腺癌細胞與心房成纖維細胞（ACFs）共培養(yǎng)，或用乳腺癌小鼠血漿處理ACFs，可促進ACFs增殖、遷移，上調(diào)纖維化標(biāo)志物表達。

圖3 乳腺癌小鼠血漿在體內(nèi)增強房顫易感性及心房成纖維細胞的促纖維化活性

4. 腫瘤分泌的sADAM10通過體循環(huán)促進其在乳腺癌小鼠心房中的上調(diào)
乳腺癌小鼠血漿及心房組織中sADAM10水平顯著升高，而心房組織中ADAM10 mRNA水平無變化；體外實驗證實乳腺癌細胞可分泌 sADAM10，且明確心房中升高的sADAM10全部來自乳腺癌病灶的分泌，經(jīng)體循環(huán)到達心房, 誘導(dǎo)心房纖維化。

圖4 腫瘤分泌的sADAM10通過體循環(huán)促進其在乳腺癌小鼠心房中的上調(diào)

5. 乳腺癌細胞中ADAM10基因敲低可降低房顫易感性及心房纖維化
乳腺癌細胞ADAM10敲低（sh-ADAM10）或使用ADAM10抑制劑（GI254023X）后，與對照組相比，小鼠血漿及心房組織sADAM10水平降低，但ADAM10 mRNA水平無顯著變化，證實sADAM10來源于腫瘤。經(jīng)電生理檢測發(fā)現(xiàn)房顫易感性下降，熒光標(biāo)測實驗提示心房傳導(dǎo)速度改善；此外，還具有心房纖維化減輕，纖維化相關(guān)基因及蛋白表達下調(diào)等現(xiàn)象。體外實驗中，ADAM10敲低或抑制劑處理的乳腺癌細胞與ACFs共培養(yǎng)，與對照組相比，可抑制ACFs的膠原合成、細胞增殖、遷移能力及纖維化信號通路活化。

圖5 乳腺癌細胞中ADAM10敲低降低心房顫動易感性

6. sADAM10通過Ephrin B2/EphB3/B4信號軸介導(dǎo)心房纖維化
乳腺癌小鼠心房組織中Ephrin B2（剪切產(chǎn)物sEphrin B2）、EphB3、EphB4蛋白水平顯著升高，而mRNA水平無變化 ，ADAM10敲低或抑制后上述蛋白水平降低；重組ADAM10 蛋白處理心房成纖維細胞可誘導(dǎo)纖維化標(biāo)志物（Col-1, Col-3, p-Smad2/3, TGF-β1, α-SMA）表達上調(diào)，敲低EphB3、EphB4可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。

圖6 乳腺癌背景下sADAM10/ Ephrin B2信號軸介導(dǎo)心房纖維化

7. 心肌成纖維細胞特異性Ephrin B2敲低可降低房顫易感性
通過AAV9載體構(gòu)建心肌成纖維細胞特異性Ephrin B2敲低小鼠模型后，經(jīng)電生理檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌小鼠房顫易感性降低，心房傳導(dǎo)速度加快，心房電重構(gòu)改善，此外，結(jié)構(gòu)重構(gòu)也有所改善。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，心肌成纖維細胞Ephrin B2敲低不影響荷瘤小鼠的腫瘤生長，也不會改變小鼠血漿及心房組織中sADAM10的表達水平。

圖7 心肌成纖維細胞特異性Ephrin B2敲低降低乳腺癌小鼠的心房顫動易感性

8.體內(nèi)外模型中成熟ADAM10（mADAM10）水平無顯著變化
無論是體內(nèi)心房組織還是體外心房成纖維細胞，mADAM10水平均未因乳腺癌或相關(guān)干預(yù)發(fā)生明顯改變。

9. 治療前乳腺癌患者血漿sEphrin B2濃度與sADAM10水平呈正相關(guān)
PTBC患者腫瘤組織及血漿中sADAM10、sEphrin B2水平顯著升高，且合并房顫的患者上述指標(biāo)更高，不同乳腺癌亞型的腫瘤組織中 ADAM10表達及sADAM10分泌能力無顯著差異，血漿中sADAM10與sEphrin B2水平呈正相關(guān)。

圖9 治療前乳腺癌患者血漿中sEphrin B2濃度與sADAM10水平呈正相關(guān)

結(jié)論：
本研究通過臨床隊列、動物實驗與細胞實驗的多維度驗證體系，首次證實未接受抗腫瘤治療的乳腺癌患者房顫患病率與心房重構(gòu)程度顯著高于健康人群；并揭示乳腺癌可獨立于抗腫瘤治療，通過分泌sADAM10經(jīng)體循環(huán)作用于心房成纖維細胞，經(jīng)sADAM10–Ephrin B2–EphB3/B4信號軸激活心房纖維化通路，最終增加房顫易感性。

作為貫穿研究全程的關(guān)鍵技術(shù)，高分辨率光學(xué)標(biāo)測（Optical Mapping）技術(shù)（設(shè)備型號：MappingLab OMS-PCIE-2002）為小鼠心房傳導(dǎo)速度量化、房顫易感性評估、心房電重構(gòu)表型驗證、靶向干預(yù)效果評價提供了精準(zhǔn)的電生理數(shù)據(jù)支撐，明確了sADAM10作為乳腺癌相關(guān)房顫標(biāo)志物與干預(yù)靶點的核心價值。