多維度電生理技術(shù)助力構(gòu)建全球首個(gè)長QT綜合征的基因編輯小型豬模型
近日，浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院莊樂南研究員、浙江大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院梁平教授及中國農(nóng)業(yè)大學(xué)杜旭光教授帶領(lǐng)的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)，在國際心血管領(lǐng)域頂級期刊《Circulation》（IF=38.6）上發(fā)表了題為“Modeling Long-QT Syndrome Using Gene-Edited Miniature Pigs”的研究論文。該項(xiàng)目獲得河南省斯高電生理研究院（斯高研究院）和河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院電生理研究所（電生理所）的深度協(xié)作與關(guān)鍵支撐。
該文章主要有兩大亮點(diǎn)：
第一，構(gòu)建全球首個(gè)長QT綜合征的基因編輯小型豬模型；
第二，通過無創(chuàng)生理信號(hào)遙測系統(tǒng)、電標(biāo)測、光標(biāo)測等多維度電生理技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，為大動(dòng)物模型的心電表型驗(yàn)證、病理機(jī)制解析及藥物治療驗(yàn)證提供了經(jīng)典范式。斯高研究院和電生理所共同完成了電生理相關(guān)研究工作。
2型長QT綜合征（LQT2）是一種由KCNH2基因功能缺失突變引起的遺傳性心律失常疾病，臨床表現(xiàn)包括QT間期延長，并易引發(fā)心源性猝死等惡性心臟事件。KCNH2基因編碼心肌電壓門控鉀通道hERG的α亞基，該通道負(fù)責(zé)產(chǎn)生延遲整流鉀電流（IKr），對心肌復(fù)極至關(guān)重要。由于人類原代心肌組織難以獲取，目前研究多依賴轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型或動(dòng)物模型。然而，IKr在人類心室肌復(fù)極中起主導(dǎo)作用，而在嚙齒類動(dòng)物中抑制IKr對復(fù)極影響不顯著，因此構(gòu)建能夠準(zhǔn)確模擬人類LQT2病理特征的大動(dòng)物模型成為迫切需求。
該研究成功構(gòu)建全球首個(gè)KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，系統(tǒng)模擬了人類LQT2的臨床與病理表型，為疾病機(jī)制解析與藥物研發(fā)提供了重要平臺(tái)。
研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞核移植和胚胎移植，成功獲得國際首個(gè)KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，構(gòu)建流程如下：（圖 1）
圖1. 基因編輯豬構(gòu)建流程
利用這一模型，研究團(tuán)隊(duì)對 1 頭清醒、無束縛狀態(tài)的野生型小型豬和 1 頭基因突變小型豬進(jìn)行 24 小時(shí)心電圖持續(xù)監(jiān)測（無創(chuàng)生理信號(hào)遙測系統(tǒng)，設(shè)備品牌：MappingLab），結(jié)果顯示突變豬表現(xiàn)出 QT 間期延長、T 波異常及 QT 離散度增加，與人類 LQT2 的表型高度相似，并記錄到自發(fā)性尖端扭轉(zhuǎn)型室速等惡性心律失常事件，相關(guān)檢測結(jié)果通過圖 2 呈現(xiàn)，包括 42 月齡野生型與基因突變豬的心電圖、兩者 Bazett 校正 QT 間期（QTCB）柱狀圖、QT/RR 關(guān)系散點(diǎn)圖及線性回歸（實(shí)線為擬合線）、QT 間期 Poincaré 散點(diǎn)圖（野生型置信區(qū)間面積 4.68，基因突變豬 7.56），以及 9 月齡基因突變豬動(dòng)態(tài)心電圖記錄的自發(fā)性尖端扭轉(zhuǎn)型室速。
圖2. 基因突變豬心電異常
圖3. 在體誘導(dǎo)室速實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了研究基因突變豬離子通道的改變，利用光標(biāo)測技術(shù)（Optical Mapping; 設(shè)備品牌：MappingLab）發(fā)現(xiàn)，與野生型豬相比，基因突變豬表現(xiàn)出明顯的室間復(fù)極化延長與傳導(dǎo)延遲，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 4，左上圖為電壓敏感染料標(biāo)測的右心室組織塊時(shí)間傳導(dǎo)圖及動(dòng)作電位復(fù)極 80% 時(shí)程（APD80），清晰呈現(xiàn)基因突變豬復(fù)極延長、傳導(dǎo)延遲的特征；右上圖為不同基礎(chǔ)周期長度（BCL）下 APD80 點(diǎn)圖；左下圖為不同 BCL 下 APD30/APD80 點(diǎn)圖；右下圖為鈣敏感染料標(biāo)測的鈣瞬變傳導(dǎo)時(shí)長及回收 80% 時(shí)長圖，紅色箭頭指示基因突變豬鈣瞬變暫�，F(xiàn)象。
圖4. 光標(biāo)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果
此外，研究還發(fā)現(xiàn)基因突變豬心臟出現(xiàn)鈣瞬變異常，研究人員使用鈣離子阻斷劑地爾硫卓進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)其可緩解鈣瞬變暫停與動(dòng)作電位時(shí)程延長，首次通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鈣通道阻滯劑可能減少 LQT2 患者的惡性心律不齊事件，相關(guān)干預(yù)效果見圖 5，左上圖為不同濃度地爾硫卓處理后右心室組織塊鈣瞬變時(shí)長圖，可見 10μM 地爾硫卓可恢復(fù)基因突變豬鈣瞬變暫停；右上圖為鈣瞬變峰值點(diǎn)圖；左下圖為動(dòng)作電位代表圖；右下圖為 APD30/APD50/APD80 比較線圖，顯示 30μM 地爾硫卓可使基因突變豬 APD 恢復(fù)至野生型基線水平。
圖5. 地爾硫卓干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖6. 膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果
單核轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步揭示，突變豬心肌組織中鉀、鈣離子通道失衡，并伴有代謝水平下降與炎癥通路激活，為深入理解LQT2的復(fù)雜病理機(jī)制提供了新視角（圖7）。
圖7. 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
綜上，本研究成功構(gòu)建全球首個(gè)能夠高度模擬人類LQT2的基因編輯小型豬模型。相較于現(xiàn)有的長 QT 綜合征小動(dòng)物模型，該大動(dòng)物模型的建立是一項(xiàng)重大突破，為 LQT2 的基因治療研究和臨床前藥物篩選提供了極高的應(yīng)用價(jià)值。鑒于 hERG 通道既是心律失常藥物治療的核心靶點(diǎn)，又與獲得性長 QT 綜合征密切相關(guān)，此模型具備廣泛的科研與臨床應(yīng)用前景。
該文章主要有兩大亮點(diǎn)：
第一，構(gòu)建全球首個(gè)長QT綜合征的基因編輯小型豬模型；
第二，通過無創(chuàng)生理信號(hào)遙測系統(tǒng)、電標(biāo)測、光標(biāo)測等多維度電生理技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，為大動(dòng)物模型的心電表型驗(yàn)證、病理機(jī)制解析及藥物治療驗(yàn)證提供了經(jīng)典范式。斯高研究院和電生理所共同完成了電生理相關(guān)研究工作。
2型長QT綜合征（LQT2）是一種由KCNH2基因功能缺失突變引起的遺傳性心律失常疾病，臨床表現(xiàn)包括QT間期延長，并易引發(fā)心源性猝死等惡性心臟事件。KCNH2基因編碼心肌電壓門控鉀通道hERG的α亞基，該通道負(fù)責(zé)產(chǎn)生延遲整流鉀電流（IKr），對心肌復(fù)極至關(guān)重要。由于人類原代心肌組織難以獲取，目前研究多依賴轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型或動(dòng)物模型。然而，IKr在人類心室肌復(fù)極中起主導(dǎo)作用，而在嚙齒類動(dòng)物中抑制IKr對復(fù)極影響不顯著，因此構(gòu)建能夠準(zhǔn)確模擬人類LQT2病理特征的大動(dòng)物模型成為迫切需求。
該研究成功構(gòu)建全球首個(gè)KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，系統(tǒng)模擬了人類LQT2的臨床與病理表型，為疾病機(jī)制解析與藥物研發(fā)提供了重要平臺(tái)。
研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞核移植和胚胎移植，成功獲得國際首個(gè)KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，構(gòu)建流程如下：（圖 1）
圖1. 基因編輯豬構(gòu)建流程
利用這一模型，研究團(tuán)隊(duì)對 1 頭清醒、無束縛狀態(tài)的野生型小型豬和 1 頭基因突變小型豬進(jìn)行 24 小時(shí)心電圖持續(xù)監(jiān)測（無創(chuàng)生理信號(hào)遙測系統(tǒng)，設(shè)備品牌：MappingLab），結(jié)果顯示突變豬表現(xiàn)出 QT 間期延長、T 波異常及 QT 離散度增加，與人類 LQT2 的表型高度相似，并記錄到自發(fā)性尖端扭轉(zhuǎn)型室速等惡性心律失常事件，相關(guān)檢測結(jié)果通過圖 2 呈現(xiàn)，包括 42 月齡野生型與基因突變豬的心電圖、兩者 Bazett 校正 QT 間期（QTCB）柱狀圖、QT/RR 關(guān)系散點(diǎn)圖及線性回歸（實(shí)線為擬合線）、QT 間期 Poincaré 散點(diǎn)圖（野生型置信區(qū)間面積 4.68，基因突變豬 7.56），以及 9 月齡基因突變豬動(dòng)態(tài)心電圖記錄的自發(fā)性尖端扭轉(zhuǎn)型室速。
圖2. 基因突變豬心電異常
團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將豬麻醉開胸后，通過電標(biāo)測技術(shù)（Electrical Mapping; 設(shè)備品牌：MappingLab）記錄在體誘導(dǎo)室速實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示相同刺激條件下，野生型豬心臟被成功起搏，刺激停止后立即恢復(fù)為正常的竇性心律，而基因突變豬則誘發(fā)出強(qiáng)烈室顫，刺激停止后的傳導(dǎo)圖出現(xiàn)多個(gè)波裂，提示其心室復(fù)極不均一，易發(fā)惡性心律失常，圖 3 左圖為麻醉狀態(tài)下野生型與基因突變豬經(jīng)短陣快速刺激（S1S1）誘導(dǎo)的心電圖（基因突變豬出現(xiàn)持續(xù)性室顫），右圖為傳導(dǎo)圖，展示了刺激前基礎(chǔ)竇性心律、野生型刺激后竇性心律及基因突變豬刺激后心律失常的心臟傳導(dǎo)特征。
圖3. 在體誘導(dǎo)室速實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了研究基因突變豬離子通道的改變，利用光標(biāo)測技術(shù)（Optical Mapping; 設(shè)備品牌：MappingLab）發(fā)現(xiàn)，與野生型豬相比，基因突變豬表現(xiàn)出明顯的室間復(fù)極化延長與傳導(dǎo)延遲，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 4，左上圖為電壓敏感染料標(biāo)測的右心室組織塊時(shí)間傳導(dǎo)圖及動(dòng)作電位復(fù)極 80% 時(shí)程（APD80），清晰呈現(xiàn)基因突變豬復(fù)極延長、傳導(dǎo)延遲的特征；右上圖為不同基礎(chǔ)周期長度（BCL）下 APD80 點(diǎn)圖；左下圖為不同 BCL 下 APD30/APD80 點(diǎn)圖；右下圖為鈣敏感染料標(biāo)測的鈣瞬變傳導(dǎo)時(shí)長及回收 80% 時(shí)長圖，紅色箭頭指示基因突變豬鈣瞬變暫�，F(xiàn)象。
圖4. 光標(biāo)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果
此外，研究還發(fā)現(xiàn)基因突變豬心臟出現(xiàn)鈣瞬變異常，研究人員使用鈣離子阻斷劑地爾硫卓進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)其可緩解鈣瞬變暫停與動(dòng)作電位時(shí)程延長，首次通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鈣通道阻滯劑可能減少 LQT2 患者的惡性心律不齊事件，相關(guān)干預(yù)效果見圖 5，左上圖為不同濃度地爾硫卓處理后右心室組織塊鈣瞬變時(shí)長圖，可見 10μM 地爾硫卓可恢復(fù)基因突變豬鈣瞬變暫停；右上圖為鈣瞬變峰值點(diǎn)圖；左下圖為動(dòng)作電位代表圖；右下圖為 APD30/APD50/APD80 比較線圖，顯示 30μM 地爾硫卓可使基因突變豬 APD 恢復(fù)至野生型基線水平。
圖5. 地爾硫卓干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因突變豬心室肌細(xì)胞的 IKr 峰值電流密度與尾電流密度均顯著降低，從電生理層面確認(rèn)了通道功能缺陷，圖 6 左圖為野生型與基因突變豬原代心肌細(xì)胞 IKr 電流圖（黑線為基線，綠線為 E-4031 處理后）；中間圖為 E-4031 敏感性 IKr 電流（通過兩次電流相減獲得）；右圖為 E-4031 敏感性電流密度統(tǒng)計(jì)分析，直觀呈現(xiàn)基因突變豬 IKr 電流密度顯著降低的特征。
圖6. 膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果
單核轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步揭示，突變豬心肌組織中鉀、鈣離子通道失衡，并伴有代謝水平下降與炎癥通路激活，為深入理解LQT2的復(fù)雜病理機(jī)制提供了新視角（圖7）。
圖7. 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
綜上，本研究成功構(gòu)建全球首個(gè)能夠高度模擬人類LQT2的基因編輯小型豬模型。相較于現(xiàn)有的長 QT 綜合征小動(dòng)物模型，該大動(dòng)物模型的建立是一項(xiàng)重大突破，為 LQT2 的基因治療研究和臨床前藥物篩選提供了極高的應(yīng)用價(jià)值。鑒于 hERG 通道既是心律失常藥物治療的核心靶點(diǎn)，又與獲得性長 QT 綜合征密切相關(guān)，此模型具備廣泛的科研與臨床應(yīng)用前景。
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