Pipetty電動(dòng)移液器在肝素凝血時(shí)間測(cè)定（兔全血法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案旨在檢測(cè)肝素抗凝活性，為提升實(shí)驗(yàn)室液體處理的精準(zhǔn)性與效率，引入 Pipetty 電動(dòng)移液器。依托其專(zhuān)利溫度控制技術(shù)，通過(guò)內(nèi)置傳感器實(shí)時(shí)校正手部熱量導(dǎo)致的誤差，完美適配高精度實(shí)驗(yàn)需求。筆式操作設(shè)計(jì)大幅降低手部勞損，避免腱鞘炎風(fēng)險(xiǎn)。一鍵連續(xù)分液功能可將重復(fù)移液時(shí)間縮短 1/2 至 2/3，且適配主流品牌吸頭，無(wú)需額外采購(gòu)成本。該設(shè)備能消除人工操作差異，保障實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，同時(shí)提升工作效率，為科研質(zhì)量與人員體驗(yàn)雙重賦能。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      肝素凝血時(shí)間測(cè)定（兔全血法）是體外評(píng)估肝素抗凝活性的實(shí)驗(yàn)方法，原理核心圍繞肝素的抗凝機(jī)制展開(kāi)：肝素可與抗凝血酶（AT）特異性結(jié)合，顯著增強(qiáng) AT 對(duì)凝血酶（Ⅱa 因子）、因子 Ⅹa 等關(guān)鍵凝血因子的抑制活性，進(jìn)而阻斷凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，延緩血液凝固。將定量稀釋的肝素與新鮮兔全血混合，在 37℃恒溫條件下，觀察血液從液態(tài)到凝固的時(shí)間。正常兔全血有固有凝血時(shí)間，加入肝素后，其凝固時(shí)間會(huì)隨肝素活性 / 濃度升高而延長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)比可量化肝素抗凝效果，同時(shí)設(shè)生理鹽水空白對(duì)照排除干擾。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-1000、MSIC90-001-10mL；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 離心管、96 孔酶標(biāo)板（平底，透明）；
④ 采血針。
 
2、試劑和材料
① 肝素標(biāo)準(zhǔn)品；
② 供試品；
③ 氯化鈉注射液；
④ 兔血漿；
⑤ 枸椽酸鈉溶液。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取肝素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)加滅菌注射用水溶解使成每1mL中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存。
2、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備：試驗(yàn)當(dāng)日，使用電動(dòng)移液器，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組（dS₃、dS₂、dS₁）用氯化鈉注射液配制成3種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值（r）應(yīng)相等；調(diào)節(jié)劑量使低劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間較不加肝素對(duì)照管明顯延長(zhǎng)，一般以大于1.5倍空白血漿的凝結(jié)時(shí)間為宜。高劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間，以不超過(guò)60分鐘為宜，其稀釋液一般可制成每1mL中含肝素2～5單位，r為1∶0.7左右；
　3、供試品溶液與稀釋液的制備：按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（AT），制成高、中、低(dT₃、dT₂、dT₁）3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值（r）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品各劑量組的凝結(jié)時(shí)間應(yīng)相近。
　　4、血漿的制備：迅速收集兔或豬血置預(yù)先放有109mmol/L枸椽酸鈉溶液的容器中，枸椽酸鈉溶液與血液容積比為1∶9，邊收集邊輕輕振搖，混勻，室溫下1500×g離心不少于15分鐘（g為重力常數(shù)）。立即吸出血漿，并分成若干份分裝于適宜容器內(nèi)，低溫凍結(jié)貯存。臨用時(shí)置37℃±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過(guò)濾，使用過(guò)程中在4～8℃放置。
　5、取管徑均勻、清潔干燥的小試管若干支，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，每管加入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液0.lmL，每種濃度3管。取剛抽出的兔血適量，分別注入小試管內(nèi)，每管0.9mL，立即混勻,避免產(chǎn)生氣泡，并開(kāi)始計(jì)算時(shí)間。將小試管置37℃±0.5℃恒溫水浴中，從動(dòng)物釆血時(shí)起至小試管放入恒溫水浴的時(shí)間不得超過(guò)3分鐘，注意觀察并記錄各管的凝結(jié)時(shí)間。
 
四、結(jié)果判定
1、迅速將混勻后的試管放回 37℃恒溫水箱，保持試管垂直靜置，避免觸碰。從計(jì)時(shí)開(kāi)始，每隔 30 秒輕輕取出試管，緩慢傾斜 45°（動(dòng)作輕柔，避免晃動(dòng)），觀察血液流動(dòng)性：
若血液仍呈液態(tài)、可沿管壁流動(dòng)，立即放回水箱繼續(xù)觀察；
若血液不再流動(dòng)、管壁出現(xiàn)凝固絮狀物（或形成半固體狀），立即停止秒表，記錄此時(shí)的時(shí)間（即為該濃度肝素的 “凝血時(shí)間”）。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。