Langendorff離體心臟灌流技術(shù)助力成年小鼠原代心肌細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)

Protocol
（成年小鼠原代心肌細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)案例）

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
（一）主要試劑：
肝素鈉溶液、灌流液、消化液、終止緩沖液。
（二）主要器材：

灌流針、眼科鑷、顯微鑷、眼科剪、手術(shù)剪、100 um細(xì)胞篩、注射器、30 mm培養(yǎng)皿、離心管、手術(shù)縫線（6-0）、滴管。

（三）主要溶液配方：
1. 灌流液：

pH調(diào)節(jié)：使用NaOH在35 ℃下調(diào)節(jié)至pH 7.46；使用0.5 M的NaOH儲(chǔ)備溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

2. 消化液：
體積： 25 ml/小鼠

3. 終止緩沖液：
體積：20 ml/小鼠

特別說明： 請(qǐng)勿存儲(chǔ)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天現(xiàn)配。

二、小鼠心臟獲取與處理
1. 為小鼠腹腔注射肝素（350 U/20 g），15-20 分鐘后將小鼠頸椎脫臼處死。
2. 將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，打開胸腔，切開主動(dòng)脈和腔靜脈，隔離并取出心臟。
3. 將心臟放置在預(yù)冷的灌流液中，剪除心臟上的肺、胸腺、脂肪、食管和氣管。
4. 暴露主動(dòng)脈后，將灌流針插入主動(dòng)脈，用6-0的絲線扎緊主動(dòng)脈，排除殘血后移至Langendorff灌流系統(tǒng)中灌流。
灌流溫度：37 ℃；灌流速度：2-4 ml/min。

三、心肌細(xì)胞消化
1. 逆行灌注含氧灌流液3-6分鐘，排除心臟殘血。

2. 逆行灌注消化液5-8分鐘后，用無菌剪刀切除心臟的特定心室區(qū)域。(根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整消化時(shí)間)

3. 將切除的心室組織放入2 ml的終止緩沖液中，用剪刀將組織切成小塊，用顯微鑷輕輕挑散組織。
 

4. 加入2 ml終止緩沖液（室溫），使細(xì)胞懸液與終止緩沖液混合，將混合后的細(xì)胞懸液過濾。
 

5. 室溫靜置30分鐘后，緩慢棄去上清液。

顯微鏡下觀察1 Hz刺激下原代心肌細(xì)胞的狀態(tài)

四、注意事項(xiàng)
灌注消化液時(shí)，消化時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。