Langendorff離體心臟灌流技術(shù)助力大動物心室肌楔形組織塊光標測實驗
實驗概要：
心臟電生理紊亂（如 QT 間期延長、早后除極等）是室性心律失常乃至猝死的重要誘因。傳統(tǒng)研究模型存在諸多局限：離體心肌細胞失去整體組織結(jié)構(gòu)，難以反映跨室壁電生理差異；在體動物模型則受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)干擾，難以精準解析局部電活動機制。
心室肌楔形組織塊，是一種通過冠狀動脈灌注離體心臟組織、保留心肌電活動特性的實驗?zāi)Ｐ�，可用于模擬生理或病理狀態(tài)下的心臟電傳導(dǎo)。作為心臟電生理研究的重要工具，它在揭示跨室壁復(fù)極離散與室性心律失常機制方面具有絕對優(yōu)勢，其應(yīng)用涵蓋藥物安全性評價（如 QT 間期延長藥物）、缺血再灌注保護策略優(yōu)化及遺傳性心律失常機制探索等方面，為臨床防治提供關(guān)鍵實驗依據(jù)。
實驗?zāi)康模?/strong>
利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)維持豬心臟、心室肌楔形組織塊在離體狀態(tài)下的正常生理活動；利用高分辨熒光標測技術(shù)檢測心室肌楔形組織塊動作電位時程、動作電位時程離散、傳導(dǎo)速度、傳導(dǎo)離散度、鈣瞬變時程、鈣瞬變時程離散、鈣傳導(dǎo)速度、傳導(dǎo)離散度、ECG等電生理指標。
實驗動物：
巴馬豬、成年豬、羊等大動物（本次分享為巴馬豬心臟心室肌楔形組織塊實驗案例）
實驗方法：
Langendorff離體心臟灌流技術(shù)；高分辨熒光標測技術(shù)。
實驗原理：
1、Langendorff離體心臟灌流技術(shù)原理：離體動物心臟在恒溫恒流條件下，將心臟套管插入主動脈，逆行灌流含氧的灌注液，由冠狀動脈灌流心肌，灌流液經(jīng)冠狀靜脈竇從右心房、右心室、肺動脈端流出，以維持離體心臟在外界正常的生理活動。
2、高分辨熒光標測技術(shù)原理：在可興奮樣本上負載熒光染料，通過高速相機記錄熒光變化來反應(yīng)樣本中電壓或各種離子濃度的變化，可同步記錄動作電位與鈣信號等電生理指標的改變。
Protocol（心室肌楔形組織塊的光標測實驗案例）
一、實驗前準備
（一）主要試劑：
肝素鈉溶液、KH液、舒泰50、氯化鉀溶液、高鉀停搏液、Blebbistatin試劑、Pluronic F-127試劑、Rhod-2AM試劑、RH-237試劑等。
（二）主要器材：
血管夾、灌流針、眼科剪、眼科鑷、顯微鑷、手術(shù)剪、注射器、手術(shù)縫線（6-0）等。
（三）主要溶液配方：
1、KH液
2、肝素鈉溶液：生理鹽水配制，1000 U/mL
3、氯化鉀溶液：生理鹽水配制，2M
4、高鉀停搏液
二、巴馬豬心臟心室肌楔形組織塊模型的制備
（一）豬心臟獲取與處理
1、實驗豬的體重：8~15kg，肌肉注射舒泰50（0.1mL/kg）。待實驗豬麻醉后耳緣靜脈注射肝素鈉溶液（1000 U/kg），15 min后靜脈注射2M氯化鉀溶液（1mL/kg）處死。
2、將實驗豬仰臥固定于實驗臺上，倒“T”形開胸，暴露心臟。提起肺葉，沿肺后部快速剪下心臟，并置于預(yù)冷的KH液中。
3、迅速找到主動脈，剪去多余組織；在鑷子輔助下迅速將主動脈連接到灌流針上，用扎帶固定心臟，逆行灌注含氧（95％O2，5％CO2）KH液使心臟復(fù)跳，排出殘血。
（二）心室肌楔形組織塊Langendorff灌流
1、殘血排盡后，將心臟轉(zhuǎn)移至Langendorff灌流系統(tǒng)，待心臟狀態(tài)穩(wěn)定后（可應(yīng)用多通道電生理標測技術(shù)進行電生理信號檢測），灌注低溫高鉀停搏液（10mmol/L KCl）以減少損傷。
2、心臟停跳后，選取心臟冠狀動脈分支較多的組織，修剪長約10-20mm、寬約5-10mm、厚約3-5mm 的心室肌楔型組織塊，用灌流針固定組織塊，置于含氧飽和（95％O2，5％CO2）KH液的恒溫浴槽中，持續(xù)充氧灌注。
灌流速率：2-3 mL/min，灌流溫度：37±0.5 ℃。
心室肌楔形組織塊轉(zhuǎn)移至含氧飽和（95％O2，5％CO2）KH液的恒溫浴槽
（一）心室肌楔形組織塊停跳及熒光染色
1、為了防止光學(xué)記錄過程中出現(xiàn)運動偽影，在100mL灌流液中加入300-600 μL Blebbistatin（終濃度為10-20 μM），循環(huán)灌流15min。
2、在灌流罐中加入50 μL Pluronic F-127（終濃度為0.01%），循環(huán)灌流10 min。
3、將100 μL鈣指示劑Rhod-2AM（終濃度為1 μM）從加藥口緩慢注射，循環(huán)灌流15 min。最后加入100 μL電壓敏感染料RH-237（終濃度為2 μM）循環(huán)灌流15 min。
（二）數(shù)據(jù)采集
1、用兩個520 nm LED燈光激發(fā)心室肌楔形組織塊熒光信號，通過光路系統(tǒng)中的二相色鏡和不同波長的濾光片分離熒光信號，由兩個高速sCMOS科研相機分別采集動作電位信號和鈣離子信號。
激發(fā)光下的心室肌楔形組織塊
四、注意事項
1、用去離子水沖洗系統(tǒng)（冷-熱-冷），使系統(tǒng)保持潔凈，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵，使出液口達到相應(yīng)的灌流速度；
2、KH液使用前需要提前充氧（ 95% O2 +5% CO2 ）飽和，使灌流液達到氧飽和狀態(tài)；
3、排出灌流系統(tǒng)內(nèi)空氣，使灌流液充滿整個管路；
4、打開循環(huán)水加熱系統(tǒng)，調(diào)節(jié)循環(huán)水溫度，使流出的灌流液溫度為 37 ℃左右；
5、在光標測實驗過程中，通過灌流系統(tǒng)注射停跳劑和熒光染料時注意避光；
6、通過灌流系統(tǒng)注射停跳劑和熒光染料時，需緩慢勻速注射，防止堵塞冠脈造成心肌梗死。
★大動物使用心室肌楔形組織塊進行電生理標測的優(yōu)勢：
1、 直接觀測跨室壁電生理差異，精準評估復(fù)極離散度：心室肌楔形組織塊保留了心內(nèi)膜、心外膜等跨壁心肌結(jié)構(gòu)，可記錄動作電位及跨壁心電圖；
2、 同一心臟可制備多塊樣本，提高實驗重復(fù)性：能有效減少不同個體間的生物學(xué)差異對實驗結(jié)果的干擾，使各組間的比較更具可靠性；
3、 同步關(guān)聯(lián)細胞電活動：使用楔形塊分離心室肌細胞，記錄細胞水平的電生理信號，實現(xiàn)細胞電活動與整體心電信號的直接關(guān)聯(lián)。
當(dāng)前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于缺血再灌注損傷、心律失常機制探索、新型抗心律失常藥物研發(fā)等領(lǐng)域。心室肌楔形組織塊標測技術(shù)的標準化與推廣，將推動心臟電生理研究從 “現(xiàn)象描述” 向 “機制解析”升級，為心血管疾病基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化提供更堅實的實驗基礎(chǔ)。
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