影響mRNA遞送效率的關(guān)鍵機(jī)制及基于tLNP的體內(nèi)CAR-T靶向CD7的優(yōu)勢(shì)

本文來源于微信公眾：CGT未來   作者：細(xì)胞也迷茫

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）能夠?qū)崿F(xiàn)高效地將mRNA遞送至T細(xì)胞，從而在體內(nèi)直接生成CAR-T細(xì)胞，而無需進(jìn)行體外操作。這一策略在心臟纖維化、癌癥和自身免疫性疾病等的臨床前研究中顯示出良好的治療效果。盡管在不同研究中針對(duì)T細(xì)胞表面受體（如 CD2、CD4、CD5、CD7、CD8 或 CD4/8 雙靶向組合）的tLNP介導(dǎo)的體內(nèi)CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出不同的效率和性能，但這些差異背后的機(jī)制仍不清楚。

近日，來自賓夕法尼亞大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)，在bioRxiv上發(fā)表了文章“Rapid receptor internalization potentiates CD7-targeted lipid nanoparticles for efficient mRNA delivery to T cells and in vivo CAR T-cell engineering”。文章系統(tǒng)比較了多種靶向分子（如CD2、CD4、CD5、CD7、CD8）的tLNP遞送效率，揭示了影響mRNA遞送效率的關(guān)鍵機(jī)制，并明確了靶向CD7的tLNP在體內(nèi)外均具有最高的遞送效率和功能性CAR-T細(xì)胞生成能力。

研究內(nèi)容
1、tLNP遞送效率的系統(tǒng)比較
系統(tǒng)比較tLNP靶向不同T細(xì)胞表面受體（CD2、CD4、CD5、CD7、CD8和CD4/8組合）的mRNA遞送效率，明確哪種靶向分子最優(yōu)。

使用ZsGreen報(bào)告基因mRNA作為tLNP的負(fù)載物，在人類T細(xì)胞中進(jìn)行遞送實(shí)驗(yàn)，靶向CD7的tLNP在CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞中均表現(xiàn)出最高的遞送效率和蛋白表達(dá)水平，aCD7/tLNP的ZsGreen陽性率高達(dá)76.4%，顯著優(yōu)于其他靶向分子。

2、受體內(nèi)化能力決定tLNP遞送效率
為了探討遞送效率差異背后的機(jī)制，研究比較了不同受體的表達(dá)量和內(nèi)化能力。

使用公開的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞表面受體（CD2、CD4、CD5、CD7、CD8）的表達(dá)水平，CD2的表達(dá)量最高，是CD7和CD5的5倍，但CD2的mRNA遞送效率遠(yuǎn)低于CD7和CD5。

使用IncuCyte® Fabfluor-pH抗體標(biāo)記系統(tǒng)，定量分析抗體-受體復(fù)合物的內(nèi)化動(dòng)力學(xué)，CD7的抗體-受體復(fù)合物內(nèi)化能力最強(qiáng)，顯著高于CD5和CD2。CD7的內(nèi)化能力與抗體克隆無關(guān)，是受體的固有特性。

3、 tLNP在PBMC中的遞送效率
在PBMC中評(píng)估tLNP（靶向CD2、CD4、CD5、CD7、CD8或CD4/8組合）對(duì)T細(xì)胞的mRNA遞送效率。

使用流式細(xì)胞術(shù)分析ZsGreen在不同免疫細(xì)胞亞群（T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞）中的表達(dá)。aCD7/tLNP在PBMC中仍表現(xiàn)出最高的T細(xì)胞遞送效率，單核細(xì)胞在所有tLNP處理組中均顯示較高的ZsGreen陽性率，而B細(xì)胞幾乎沒有ZsGreen表達(dá)，NK細(xì)胞在aCD7/tLNP處理下顯示出較高的ZsGreen陽性率，符合CD7在NK細(xì)胞中的高表達(dá)水平。

4、 tLNP的體內(nèi)CAR T細(xì)胞生成

使用人源化小鼠模型（PBMC-NSG小鼠），通過尾靜脈注射aCD7/tLNP-ZsGreen，評(píng)估m(xù)RNA遞送效率。在脾臟T細(xì)胞中，aCD7/tLNP處理后CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的ZsGreen陽性率分別為59.3%和88.7%，在外周血T細(xì)胞中，ZsGreen陽性率與脾臟中的結(jié)果相似，CD8⁺ T細(xì)胞的ZsGreen表達(dá)水平顯著高于CD4⁺ T細(xì)胞，這與CD8⁺ T細(xì)胞表面更高的CD7表達(dá)量一致。

在PBMC-NSG人源化小鼠中，通過尾靜脈注射aCD7/tLNP-CAR mRNA，評(píng)估CAR T細(xì)胞生成和B細(xì)胞清除效果。aCD7/tLNP-CAR處理后，CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的CAR表達(dá)率分別為33.3%和50.6%，顯著高于靶向CD2的tLNP。aCD7/tLNP-CAR處理的小鼠脾臟中，CD20⁺ B細(xì)胞比例顯著降低，僅為0.5%，相比對(duì)照組（4.1%-7.5%）減少了90%以上。免疫組織化學(xué)顯示，aCD7/tLNP-CAR處理的小鼠脾臟中CD20⁺ B細(xì)胞幾乎完全清除，同時(shí)觀察到Granzyme B的強(qiáng)陽性染色，表明CAR T細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性活性。

總結(jié)
這項(xiàng)研究為基于tLNP的體內(nèi)CAR-T細(xì)胞療法提供了重要的理論依據(jù)：優(yōu)先選擇內(nèi)化快速的受體，如CD7，而非豐度高的。CD7之所以是最優(yōu)的靶向受體，主要基于以下幾點(diǎn)：
內(nèi)化能力最強(qiáng)：CD7的抗體-受體復(fù)合物內(nèi)化能力顯著優(yōu)于其他受體，是tLNP遞送效率的關(guān)鍵決定因素。
廣泛表達(dá)：CD7在CD4⁺ T細(xì)胞、CD8⁺ T細(xì)胞和NK細(xì)胞中均有高表達(dá)，覆蓋了更多的免疫細(xì)胞類型。
體內(nèi)外表現(xiàn)優(yōu)異：無論在體外T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、PBMC實(shí)驗(yàn)，還是人源化小鼠模型中，aCD7/tLNP均表現(xiàn)出最優(yōu)的mRNA遞送效率。
功能性強(qiáng)：通過aCD7/tLNP生成的CAR T細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原特異性殺傷能力，能夠高效清除靶向細(xì)胞。