Pipetty 電動移液器在副豬格拉瑟菌檢測中的應(yīng)用

方案摘要：本方案旨在界定Pipetty電動移液器在豬格拉瑟�。ǜ必i格拉瑟菌）巢式PCR檢測中的具體應(yīng)用流程，通過標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)合該移液器精準(zhǔn)、高效的液體處理優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)對副豬格拉瑟菌的快速、準(zhǔn)確檢測。方案涵蓋實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作步驟及結(jié)果判定等核心環(huán)節(jié)，為畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域開展豬格拉瑟病檢測工作提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)參考，保障檢測結(jié)果的可靠性與重復(fù)性，助力疫病的早發(fā)現(xiàn)、早防控。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是豬格拉瑟病的致病菌，本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR技術(shù)，以副豬格拉瑟菌DNA為檢測靶標(biāo)，通過兩輪特異性擴(kuò)增對靶標(biāo)基因進(jìn)行富集與擴(kuò)增。Pipetty電動移液器精準(zhǔn)移取各反應(yīng)試劑，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化PCR反應(yīng)體系，經(jīng)擴(kuò)增儀完成循環(huán)擴(kuò)增后，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)特異性條帶的出現(xiàn)情況判定樣品中是否含有副豬格拉瑟菌。巢式PCR技術(shù)憑借兩輪擴(kuò)增的特異性篩選，可顯著提高檢測的靈敏度與特異性，結(jié)合Pipetty電動移液器的高精度移液能力，有效降低實(shí)驗(yàn)誤差，提升檢測準(zhǔn)確性。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動化核酸提取儀；
③ PCR擴(kuò)增儀；
④ 臺式低溫高速離心機(jī)(最大離心力12000g以上)；
⑤ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)。
 
2、試劑和材料
① 陽性對照：滅活的副豬格拉瑟菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；
② 陰性對照：滅菌的TSB培養(yǎng)基；
③ 上、下游引物;
④ 核酸提取試劑盒。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過程中，使用Pipetty電動移液器，精準(zhǔn)移取提取試劑及樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進(jìn)行檢測，可將DNA置于冰上臨時(shí)保存；若需長時(shí)間存放，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
2、使用Pipetty電動移液器精準(zhǔn)移取各試劑，構(gòu)建總體積為25μL的反應(yīng)體系，具體試劑用量如下：
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）      2.5μL
dNTPs（2.5 mmol/L）            2μL
引物P1                         0.5μL
引物P2                         0.5μL
ExTag DNA聚合酶（5U/μL）      0.25μL
滅菌雙蒸水                     17.25μL
上述試劑總體積為23μL，室溫融化后，使用Pipetty電動移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，將上述試劑移取至PCR反應(yīng)管中，每移取一種試劑后更換槍頭，避免交叉污染。試劑加完后，將反應(yīng)管置于臺式低溫高速離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使液體全部聚集在管底部。隨后，用Pipetty電動移液器移取2μL制備好的樣品核酸，加入反應(yīng)管中，混勻模式，充分混勻后再次瞬時(shí)離心，確保液體完全聚集于管底，避免局部試劑濃度不均影響擴(kuò)增效果。
 
3、將配制好的反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)置如下程序：95℃預(yù)變性5min，徹底打開DNA雙鏈；隨后進(jìn)入循環(huán)階段，94℃變性45s（使DNA雙鏈解旋）、58℃退火45s（使引物與靶基因特異性結(jié)合）、72℃延伸45s（DNA聚合酶催化鏈延伸），共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保擴(kuò)增產(chǎn)物完全延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，置于2℃~8℃條件下保存，備用。
4、采用與第一輪相同的體積配比，構(gòu)建總體積23μL的反應(yīng)體系Ⅱ，室溫融化后，使用Pipetty電動移液器精準(zhǔn)移取各試劑，更換槍頭防污染，室溫融化后瞬時(shí)離心，再加入2μL第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，混勻后瞬時(shí)離心，確保反應(yīng)體系均一。
 
5、擴(kuò)增條件與上一輪一致，反應(yīng)結(jié)束后，置于2℃~8℃保存，待電泳檢測。
6、稱取1.2g瓊脂糖加入100mL核酸電泳緩沖液中加熱至沸騰，充分溶化后放涼至50℃左右，加入核酸染色劑10μL，混勻，倒入膠槽制備凝膠板。在電泳槽中加入1×TAE核酸電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。分別取樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰/陽性對照擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和2μL 6×電泳上樣緩沖液混合后，分別加樣到各凝膠孔中，取5μL DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加入一凝膠孔中。5V/cm恒壓下電泳30min左右，將電泳好的凝膠置紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，進(jìn)行判定并做好試驗(yàn)記錄。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)結(jié)果成立條件
副豬格拉瑟菌陽性對照的巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在312bp位置出現(xiàn)特異性條帶，同時(shí)陰性對照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后沒有任何條帶，則試驗(yàn)結(jié)果成立；否則結(jié)果不成立。
2、陽性判定
在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在312bp位置上出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測陽性。
3、陰性判定
在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品在312bp位置未出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測陰性。