G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的分類(lèi)、藥物的作用方式及在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）是最大的細(xì)胞表面膜受體超家族，由約1000個(gè)基因編碼，具有保守的七次跨膜（7TM）螺旋結(jié)構(gòu)。GPCR廣泛存在于人體各個(gè)組織和器官中。它們?cè)诩?xì)胞與外界環(huán)境之間傳遞信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的許多基本功能，包括感知光線、味道、氣味以及調(diào)節(jié)心跳、血壓、免疫反應(yīng)等生理過(guò)程。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，GPCR就像細(xì)胞的“接收器”，它們感知體內(nèi)外的各種信號(hào)（比如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等），并將這些信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)。由于其在生理和病理過(guò)程中的重要性，GPCR成為了現(xiàn)代藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

一、GPCR的作用與分類(lèi)
1．感官受體： 如視網(wǎng)膜中的光感受器、鼻腔中的嗅覺(jué)受體等。
2．代謝受體： 調(diào)控體內(nèi)能量代謝、糖尿病、肥胖等的藥物靶點(diǎn)。
3．神經(jīng)遞質(zhì)受體： 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、去甲腎上腺素等的信號(hào)傳導(dǎo)起作用，許多神經(jīng)精神疾病（如抑郁癥、精神分裂癥）的治療靶點(diǎn)。
4．免疫系統(tǒng)受體： 在免疫反應(yīng)和炎癥中發(fā)揮重要作用，許多免疫疾病（如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）與此相關(guān)。
5. 激素受體： 包括腎上腺素受體、腎上腺皮質(zhì)激素受體等，參與調(diào)節(jié)心血管、內(nèi)分泌等功能。

二、GPCR與藥物
由于GPCR在多種生理和病理過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，因此它們是藥物研發(fā)的核心靶點(diǎn)之一。當(dāng)前大約30%–40%的藥物直接作用于GPCR，涵蓋了抗高血壓、抗過(guò)敏、抗精神病等多種藥物。大多數(shù)GPCR藥物為小分子（約92%），而非抗體等生物模式。GPCR的藥物研究需要關(guān)注其激動(dòng)劑或拮抗劑的篩選、信號(hào)通路的激活與抑制、受體與配體的結(jié)合親和力等方面。

藥物作用方式：
激動(dòng)劑： 這類(lèi)藥物通過(guò)與GPCR結(jié)合，激活受體，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。比如β-受體激動(dòng)劑用于治療哮喘。

拮抗劑： 拮抗劑與GPCR結(jié)合，但不激活它，而是阻止其激活，從而中斷某些生理反應(yīng)。例如，抗高血壓藥物常通過(guò)拮抗某些GPCR來(lái)降低血壓。

偏向性激動(dòng)劑/拮抗劑： 這類(lèi)藥物能夠選擇性地激活或抑制受體某些特定的功能。這是現(xiàn)代GPCR藥物研究的熱點(diǎn)之一，因?yàn)樗�能夠減少副作用，提高藥物的療效。

三、GPCR與藥物研發(fā)
隨著GPCR靶向藥物的不斷研發(fā)，如何高效、精準(zhǔn)地檢測(cè)GPCR的活性、受體信號(hào)傳遞以及藥物的作用效果，已成為推動(dòng)藥物研發(fā)的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。GPCRs歷來(lái)是高通量篩選（HTS）最常篩選的目標(biāo)。

HTS是一種用于快速識(shí)別藥物靶點(diǎn)的方法，可以對(duì)數(shù)十萬(wàn)種化合物進(jìn)行靶標(biāo)篩選。成功的HTS需要大量基礎(chǔ)設(shè)施，包括結(jié)構(gòu)多樣的小分子庫(kù)，以及信息學(xué)和生物學(xué)等多個(gè)科學(xué)學(xué)科的整合。HTS檢測(cè)必須經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證，以確保其高度可重復(fù)、穩(wěn)健、低成本且兼容檢測(cè)自動(dòng)化。

GPCR HTS最常用的方法包括研究受體激活下游的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。例如，這些方法測(cè)量第二信使，如Ca2+、cAMP（環(huán)腺苷單磷酸）、IP1（肌醇單磷酸）和pERK（磷酸細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶）、基因表達(dá)報(bào)告細(xì)胞，以及β-抑制素的招募到GPCR。

1.第二信使：cAMP（環(huán)磷酸腺苷）/ Ca²⁺/ IP1（肌醇單磷酸）
現(xiàn)在已有許多兼容HTS的檢測(cè)技術(shù)可以測(cè)量這些GPCR第二信使。TR-FRET（均相時(shí)間分辨熒光）能夠持續(xù)產(chǎn)生高質(zhì)量數(shù)據(jù)，采用均質(zhì)檢測(cè)，信號(hào)和試劑穩(wěn)定性?xún)?yōu)異，兼容測(cè)驗(yàn)自動(dòng)化，且兼容384和1536孔板。

以 cAMP 為例
THUNDER™ cAMP檢測(cè)是用于定量測(cè)定細(xì)胞裂解液中的3′，5′-環(huán)單磷酸腺苷（cAMP），基于均相TR-FRET技術(shù)，兼容各種物種的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，具有簡(jiǎn)單，快速和靈敏的優(yōu)勢(shì)。試劑盒基于競(jìng)爭(zhēng)法，標(biāo)記熒光供體和受體的cAMP抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，已經(jīng)與帶有Biotin標(biāo)簽的cAMP結(jié)合，形成復(fù)合物，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，細(xì)胞裂解液中的游離cAMP會(huì)與Biotin-cAMP競(jìng)爭(zhēng)，與抗體FR-Ab2結(jié)合，阻斷信號(hào)產(chǎn)生，熒光信號(hào)強(qiáng)度與游離cAMP濃度成反比。全程僅需1h，免洗，可高通量。

圖：cAMP檢測(cè)原理，標(biāo)曲及流程

每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線，以驗(yàn)證該分析是否產(chǎn)生預(yù)期的IC50值和S/B比，并將TR-FRET信號(hào)轉(zhuǎn)換為cAMP水平。

圖：表達(dá)內(nèi)源性Gs偶聯(lián)腺苷A2a受體的U266B1細(xì)胞（2000個(gè)細(xì)胞/孔）中
激動(dòng)劑濃度-反應(yīng)曲線（圖左）和拮抗劑濃度-反應(yīng)曲線（圖右）

G蛋白偶聯(lián)受體的下游信號(hào)通路多樣，具體的信號(hào)傳遞通路取決于α亞基的類(lèi)型（Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13）。
● Gs / Gi → 檢測(cè)cAMP。檢測(cè)方法：THUNDER™ cAMP TR-FRET檢測(cè)
● Gq → 檢測(cè)Ca²⁺。檢測(cè)方法：鈣流檢測(cè)。Fluo-8免洗細(xì)胞鈣流檢測(cè)試劑盒 （abs50199-100T）

圖：GPCR的信號(hào)傳導(dǎo)
From: https://www.ktsmo.com/news2/info.aspx?itemid=421

2.下游磷酸化/轉(zhuǎn)錄因子
以Phospho-ERK為例
THUNDER TR-FRET時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，僅需1~4h。一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技術(shù)，采用夾心法，檢測(cè)胞內(nèi)ERK磷酸化水平和總ERK水平。

圖. THUNDER磷酸化蛋白檢測(cè)原理示意圖

用EGF處理HEK293細(xì)胞（50,000個(gè)細(xì)胞/孔）室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF刺激ERK1/2在T202/Y204點(diǎn)位的磷酸化。用抑制劑Erlotinib處理HEK293細(xì)胞（50,000個(gè)細(xì)胞/孔），在室溫下孵育15分鐘，然后用0.5nM EGF刺激細(xì)胞，在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Erlotinib可以抑制ERK1/2在T202/Y204點(diǎn)位的磷酸化。

圖. THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

3.基因表達(dá)報(bào)告細(xì)胞
以 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 為例

圖. 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

HEK293細(xì)胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔，細(xì)胞密度為60%。隔日轉(zhuǎn)染 pCMVFluc 及 pCMV-Rluc 質(zhì)粒，每孔0.2µg DNA，48小時(shí)后檢測(cè)雙熒光素酶活性。圖中數(shù)值代表4孔重復(fù)平均值。A: 加了R1試劑后的熒光讀數(shù)；B：加入R1試劑讀值后，繼續(xù)加 R2 緩沖液(無(wú)底物)后的熒光讀數(shù)；C：加入R1試劑讀值后，繼續(xù)加R2 1x 工作液后的熒光讀數(shù)。

螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素生成氧化螢光素（Oxyluciferin），在螢光素被氧化的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素氧化成腸酰胺（Coelenteramide），在腔腸素氧化的過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)。本試劑盒的光信號(hào)可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。該試劑盒具有檢測(cè)迅速、靈敏度高、檢測(cè)范圍廣，無(wú)細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。

4. β-Arrestin 募集和內(nèi)化（偏向性信號(hào)）
通過(guò)GPCR激活的信號(hào)通路取決于GPCR本身的一級(jí)序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)，但最終由特定配體穩(wěn)定的特定構(gòu)象以及參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子決定。目前，GPCR被認(rèn)為主要使用兩種類(lèi)型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子：G蛋白和β-arrestins 。因?yàn)?beta;-arrestin僅對(duì)磷酸化形式的GPCR具有高親和力，所以大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終由G蛋白激活介導(dǎo)。

5. 受體-配體互作：親和力檢測(cè)
SPR因其通量、靈敏度以及能夠表征mM至亞pM范圍內(nèi)結(jié)合分子的能力，以及標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)中常規(guī)提供的信息量，是藥物發(fā)現(xiàn)流程中的熱門(mén)應(yīng)用。除了親和力和靶點(diǎn)結(jié)合數(shù)據(jù)外，還可以評(píng)估化學(xué)計(jì)量和其他結(jié)合行為（異常動(dòng)力學(xué)、非特異性結(jié)合等），如HTS篩查、微分裂熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)。

HTS篩查可采用配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法，利用樣本中待測(cè)抗原與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

微分裂熒光素酶技術(shù)（Nanoluc Split Enzyme Technology）將微熒光素酶(NanoLuc)分成兩個(gè)不同的片段：大片段和小片段，兩個(gè)片段單獨(dú)不具有酶活性，而大小片段結(jié)合后恢復(fù)微熒光素酶活性。大小兩個(gè)片段可以具有高親和力或低親和力不同組合。高親和力大小片段在同一反應(yīng)體系中可以快速結(jié)合為具有酶活性的微熒光素酶，而低親和力大小片段可以借助其標(biāo)記的兩個(gè)目標(biāo)蛋白的結(jié)合而成為具有酶活性的微熒光素酶。檢測(cè)微熒光素酶大片段和小片段結(jié)合所致的微熒光素酶活性可以用于細(xì)胞蛋白的表達(dá)，調(diào)控和降解以及蛋白相互作用等領(lǐng)域的研究。

UA-Glo® Nano-luc Live Cell Assay System（UA：UA070110）微熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)試劑盒包括可以進(jìn)入細(xì)胞的微熒光素酶底物和緩沖液，可以不裂解細(xì)胞檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)微熒光素酶大小片段結(jié)合后產(chǎn)生的微熒光素酶活性，也可以檢測(cè)微熒光素酶在活細(xì)胞中的表達(dá)。該試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高，背景低，檢測(cè)范圍廣，檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定（半衰期約3hr）的優(yōu)點(diǎn)，特別適合化合物的高通量篩選。

圖. 微熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

HEK293細(xì)胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔，細(xì)胞密度為60-70%。共轉(zhuǎn)染帶分裂酶大片段及小片段標(biāo)簽的目標(biāo)分子表達(dá)質(zhì)粒，每孔 0.2µg DNA，48小時(shí)后檢測(cè) Nanoluc 熒光素酶活性，動(dòng)態(tài)讀板2小時(shí)。

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