Pipetty電動(dòng)移液器在肝素凝血時(shí)間測定（血漿復(fù)鈣法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案旨在檢測肝素抗凝活性，為提升實(shí)驗(yàn)室液體處理的精準(zhǔn)性與效率，引入 Pipetty 電動(dòng)移液器。依托其專利溫度控制技術(shù)，通過內(nèi)置傳感器實(shí)時(shí)校正手部熱量導(dǎo)致的誤差，完美適配高精度實(shí)驗(yàn)需求。筆式操作設(shè)計(jì)大幅降低手部勞損，避免腱鞘炎風(fēng)險(xiǎn)。一鍵連續(xù)分液功能可將重復(fù)移液時(shí)間縮短 1/2 至 2/3，且適配主流品牌吸頭，無需額外采購成本。該設(shè)備能消除人工操作差異，保障實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，同時(shí)提升工作效率，為科研質(zhì)量與人員體驗(yàn)雙重賦能。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      正常血漿含完整凝血因子，用枸櫞酸鈉去除鈣離子后，凝血過程停滯；重新加入鈣離子（“復(fù)鈣”）可激活內(nèi)源性凝血途徑，血漿逐漸凝固。肝素能增強(qiáng)抗凝血酶 Ⅲ 活性，抑制凝血因子 Ⅱa（凝血酶）、Ⅸa、Ⅹa 等關(guān)鍵因子，顯著延緩復(fù)鈣后的凝血進(jìn)程。通過測定復(fù)鈣后血漿出現(xiàn)纖維蛋白凝塊的時(shí)間，可間接反映體內(nèi)或體外肝素對(duì)凝血系統(tǒng)的抑制強(qiáng)度，進(jìn)而評(píng)估肝素抗凝效果，為臨床調(diào)整肝素劑量提供依據(jù)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-1000、MSIC90-001-10mL；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 玻璃試管；
④ 采血針。
 
2、試劑和材料
① 肝素標(biāo)準(zhǔn)品；
② 供試品；
③ 氯化鈉注射液；
④ 兔血漿；
⑤ 枸椽酸鈉溶液。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取肝素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)加滅菌注射用水溶解使成每1mL中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存。
2、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備：試驗(yàn)當(dāng)日，使用Pipetty電動(dòng)移液器，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組（dS₃、dS₂、dS₁）用氯化鈉注射液配制成3種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值（r）應(yīng)相等；調(diào)節(jié)劑量使低劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間較不加肝素對(duì)照管明顯延長，一般以大于1.5倍空白血漿的凝結(jié)時(shí)間為宜。高劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間，以不超過30分鐘為宜，其稀釋液一般可制成每1mL中含肝素0.5～1.5單位，r為1∶0.85左右；
　3、供試品溶液與稀釋液的制備：按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（AT），制成高、中、低(dT₃、dT₂、dT₁）3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值（r）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品各劑量組的凝結(jié)時(shí)間應(yīng)相近。
 
　　4、血漿的制備：迅速收集兔或豬血置預(yù)先放有109mmol/L枸椽酸鈉溶液的容器中，枸椽酸鈉溶液與血液容積比為1∶9，邊收集邊輕輕振搖，混勻，室溫下1500×g離心不少于15分鐘（g為重力常數(shù)）。立即吸出血漿，并分成若干份分裝于適宜容器內(nèi)，低溫凍結(jié)貯存。臨用時(shí)置37℃±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過濾，使用過程中在4～8℃放置。
　5、取管徑均勻、清潔干燥的小試管若干支，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，分別加入500μL血漿，置37℃±0.5℃恒溫水浴中5～10分鐘后，依次每管加入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液400μL及100μL 1%氯化鈣溶液，每種濃度不得少于3管，各濃度的試管支數(shù)相等，加入1%氯化鈣溶液后，立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并開始計(jì)算時(shí)間，注意觀察并記錄各管凝結(jié)時(shí)間。
 
四、結(jié)果判定
1、持續(xù)觀察血漿狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的纖維蛋白凝塊時(shí)，記錄所需時(shí)間，即為 “肝素凝血時(shí)間”。每次檢測需同時(shí)做 “正常對(duì)照血漿”，確保試劑和操作無誤差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于5%。