Pipetty電動(dòng)移液器在肝素產(chǎn)品效價(jià)測定（抗Ⅱa因子測定法 ）中的應(yīng)用

方案摘要：肝素生物測定中的抗 Ⅱa 因子測定法，是基于肝素對(duì)凝血因子 Ⅱa（即凝血酶）的特異性抑制作用，定量檢測肝素（尤其是普通肝素、低分子肝素）生物活性的關(guān)鍵方法，其核心優(yōu)勢是直接反映肝素的抗凝生物效應(yīng)（而非單純化學(xué)含量），是臨床監(jiān)測和藥品質(zhì)量控制的重要手段。為提升試驗(yàn)效率，本方案采用了Pipetty電動(dòng)移液器，核心優(yōu)勢集中于提升操作精度與效率、降低人為誤差，精準(zhǔn)度高，通過電動(dòng)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn) 0.1μL 級(jí)增量調(diào)節(jié)，避免手動(dòng)按壓力度不均導(dǎo)致的移液偏差；支持連續(xù)分液模式，批量處理 96 孔板等樣本時(shí)效率較手動(dòng)提升 3 倍以上；機(jī)身體積小重量輕，可降低長時(shí)間操作疲勞感，同時(shí)兼容多種規(guī)格吸頭，適配不同實(shí)驗(yàn)試劑需求，全方位保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性與操作便捷性。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       該方法核心是基于肝素對(duì)凝血因子 Ⅱa（凝血酶）的間接抑制作用定量其生物活性。肝素本身無直接抑酶活性，需先與血漿中抗凝血酶（AT）結(jié)合，誘導(dǎo) AT 構(gòu)象改變并激活，形成的 “肝素 - AT 復(fù)合物” 對(duì) Ⅱa 因子親和力顯著提升，可快速結(jié)合 Ⅱa 因子形成三元復(fù)合物，使其失去催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的凝血功能。實(shí)驗(yàn)中加入已知量的 AT 和 Ⅱa 因子，肝素濃度越高，被抑制的 Ⅱa 因子越多，剩余 Ⅱa 活性越低。通過加入特異性發(fā)色底物，剩余 Ⅱa 因子可水解底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，其吸光度與剩余 Ⅱa 活性正相關(guān)。借助肝素標(biāo)準(zhǔn)品繪制 “吸光度 - 濃度” 標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可反推出待檢樣本中肝素的生物活性濃度，直接反映其抗凝效應(yīng)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 酶標(biāo)儀；
④ 離心管、96 孔酶標(biāo)板（平底，透明）；
⑤ 渦旋振蕩器。
 
2、試劑和材料
① 三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液；
② 抗凝血酶溶液；
③ 凝血酶溶液；
④ 發(fā)色底物溶液；
⑤ 肝素標(biāo)準(zhǔn)品；
⑥ 供試品。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、制備供試品溶液與稀釋液：按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（AT），用三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液（pH8.4），制成4個(gè)不同濃度的溶液，相鄰兩濃度之比值（r）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品各劑量組的反應(yīng)值應(yīng)相近。
2、取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（S）系列溶液或供試品（T）系列溶液及上述緩沖液（B），按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的順序，試用Pipetty電動(dòng) 移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，依次向酶標(biāo)板各孔中分別加入20μL的上述溶液,每個(gè)濃度做三個(gè)復(fù)孔；
 
3、使用連續(xù)分液模式，每孔加入20μL的抗凝血酶溶液，混勻模式，自動(dòng)混勻，37℃平衡2分鐘；
4、再加入凝血酶溶液20μL，自動(dòng)混勻，37℃平衡2分鐘；
5、再加入發(fā)色底物溶液20μL，自動(dòng)混勻，37℃準(zhǔn)確保溫2分鐘后，再精密加入50%醋酸溶液20μL，終止反應(yīng)后，迅速冷卻至室溫。
四、結(jié)果判定
1、用酶標(biāo)儀在405nm的波長處測定各孔的吸光度。B1、B2兩孔的吸光度不得有顯著性差異。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液（或供試品系列溶液）濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別作線性回歸，按生物檢定統(tǒng)計(jì)法（通則1431）中的量反應(yīng)平行線原理4.4法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。