Pipetty電動移液器在牛肺疫病原檢測（PCR實驗）中的應用

方案摘要：牛傳染性胸膜肺炎（Contagious Bovine Pleuropneumonia，CBPP)是由絲狀支原體絲狀亞種（Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides，Mmm）引起的一種牛屬動物傳染病,又稱牛肺疫。以肺小葉間淋巴管漿液-滲出性纖維素性炎和漿液纖維素性胸膜炎為特征。健康牛與感染牛直接接觸后吸入感染牛的“飛沫”是本病的主要傳染途徑，其中感染牛的“飛沫”是傳播媒介，本病也可通過感染牛的精液和胚胎造成垂直傳播。本方案使用了日本進口產(chǎn)品，Pipetty電動移液器，利用其體積小，精度高的優(yōu)勢，有效減少使用者的手部疲勞的同時大幅度提升了檢測效率。
 
方案詳情：

• 實驗原理

牛傳染性胸膜炎PCR 實驗，以牛支原體為檢測對象，核心是特異性擴增其 16S rRNA 保守基因。通過專屬引物（僅與該基因序列互補結合），在 PCR 儀中經(jīng) 30-40 次循環(huán)：94-95℃變性使 DNA 解旋，55-65℃退火讓引物結合模板，72℃時 Taq 酶催化合成新鏈，實現(xiàn)靶基因指數(shù)級復制。擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)預期大小條帶為陽性（含病原），反之則為陰性，實現(xiàn)定性檢測。
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250及配套吸頭；
② PCR儀；
③ 高速臺式冷凍離心機；
④ 瞬時離心機；
⑤ 渦旋混勻器。
 
2、試劑和材料
① 商品化基因組 DNA 提取試劑盒（商品化試劑）；
② 引物；
③ 八連管或96孔板；
④ XPCR 反應預混合液（含 Tag 酶和染料）；
⑤ 陽性對照：pUC-TM 質粒；
⑥ 陰性對照：無核酸酶水；
⑦ DNA 分子質量標準；
⑧ 1%瓊脂糖凝膠。
 
三、實驗步驟
1、使用商品化的基因組 DNA 提取試劑盒提取鼻拭子、血液、組織和體液樣品的基因組 DNA，操作步驟參照試劑盒說明書。
 
2、標記96孔板，設置陰性對照和陽性對照，按表1反應體系將各試劑按需要的孔數(shù)加到EP管內，使用Pipetty的自動混勻模式，對試劑進行充分混合。使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液，將預混后的試劑，移取至96孔板中。取樣品 DNA模板，按每孔/2μL，連續(xù)加入到96孔板內，短暫離心后，進行 PCR 擴增。
 
3、擴增程序為 95 ℃預變性 3min；94℃45s，57℃45s，72℃1min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10min。以1%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。
 
四、結果判定
1、陰性對照不能擴增出任何條帶，且陽性對照擴增出 300 bp 左右片段，則 PCR結果判定為有效。如陽性對照不能擴增出目的大小片段，或陰性對照擴增出目的片段，則 PCR 反應無效。
2、待檢樣品擴增出大小為 300bp 左右的一條特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶分子質量大小相符，則待檢樣品判定為 Mmm 核酸陽性。
3、待檢樣品無特異性擴增條帶，則判定為Mmm 核酸陰性。