蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)——翻譯后修飾組學(xué)的介紹

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，基因?yàn)樯�命活�?dòng)提供了基礎(chǔ)的遺傳信息，而蛋白質(zhì)作為基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，是調(diào)控各類生理病理過程的核心功能分子。蛋白質(zhì)翻譯完成后，并非直接發(fā)揮功能，而是需經(jīng)過一系列精細(xì)的共價(jià)修飾過程，該過程作為蛋白質(zhì)功能調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，構(gòu)建了復(fù)雜且精密的生命調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該共價(jià)修飾過程即為蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)，其定義為：蛋白質(zhì)翻譯終止后，在特異性酶的催化作用下，通過共價(jià)結(jié)合或去除各類化學(xué)基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與生物學(xué)功能的過程。該過程不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，但可使單一蛋白質(zhì)形成多種功能異構(gòu)體，從而參與生命活動(dòng)的多層次調(diào)控。

目前已發(fā)現(xiàn)的PTM類型超過400種，質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)研究的核心技術(shù)手段，憑借高靈敏度、高分辨率及高通量的技術(shù)優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)修飾類型識別、修飾位點(diǎn)定位及修飾水平定量，為解析PTM的調(diào)控機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。本文聚焦目前研究最深入、最具代表性的四種PTM類型：磷酸化、乙酰化、泛素化以及甲基化，結(jié)合質(zhì)譜研究技術(shù)，系統(tǒng)解析其修飾機(jī)制、質(zhì)譜研究要點(diǎn)及研究意義。PEAKS軟件內(nèi)置Unimod中所有的天然翻譯后修飾及化學(xué)合成標(biāo)簽，既可以針對質(zhì)譜數(shù)據(jù)中已知的PTMs進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定與可信度判定，也可以幫助發(fā)現(xiàn)潛在的未知重要PTMs類型與位點(diǎn)。

質(zhì)譜技術(shù)：蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)研究的核心工具
蛋白質(zhì)翻譯后修飾具有“微量、動(dòng)態(tài)、多樣”的特點(diǎn)：修飾蛋白在樣本中含量極低，且修飾狀態(tài)會(huì)隨生理環(huán)境動(dòng)態(tài)變化，不同修飾類型的化學(xué)性質(zhì)差異顯著，這對檢測技術(shù)提出了極高要求。而質(zhì)譜技術(shù)，恰好完美適配這些需求：首先將蛋白質(zhì)酶解為肽段，利用電場和磁場將不同質(zhì)量/電荷比(m/z)的肽段分離，再通過檢測器分析肽段的質(zhì)量信息，進(jìn)而推斷出修飾肽段的序列、修飾位點(diǎn)和修飾類型。

目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)結(jié)合修飾肽段親和富集技術(shù)，已成為PTM組學(xué)研究的主流技術(shù)方案。該方案可實(shí)現(xiàn)低豐度修飾肽段的高效富集與精準(zhǔn)檢測，推動(dòng)PTM研究從單一蛋白修飾分析，向大規(guī)模、高通量的修飾組學(xué)層面深入，為解析蛋白質(zhì)修飾的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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01-磷酸化修飾：細(xì)胞信號的“通用開關(guān)”
磷酸化修飾是目前發(fā)現(xiàn)的最普遍、研究最透徹的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各類生理過程，是細(xì)胞信號調(diào)控的核心機(jī)制之一。

• 修飾機(jī)制

在蛋白激酶(Kinase)的催化下，將ATP(三磷酸腺苷)末端的磷酸基團(tuán)(-PO₃²⁻)共價(jià)連接到蛋白質(zhì)特定氨基酸的羥基上，這個(gè)過程可被蛋白磷酸酶(Phosphatase)逆轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)“磷酸化-去磷酸化”的動(dòng)態(tài)循環(huán)，精準(zhǔn)調(diào)控蛋白質(zhì)活性。其主要修飾靶點(diǎn)為絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)三種氨基酸殘基。

 

• 質(zhì)譜研究要點(diǎn)

磷酸化肽段在樣本中含量極低，且易被非磷酸化肽段干擾。因此，質(zhì)譜研究中需通過特異性富集技術(shù)提升檢測靈敏度，常用富集方法包括：

1. 固定化金屬離子親和色譜（IMAC）：利用磷酸基團(tuán)與金屬離子（如Fe³⁺、Ga³⁺）的特異性結(jié)合，高效富集磷酸化肽段，適用于大規(guī)模磷酸化組學(xué)研究；
2. 金屬氧化物親和色譜（MOAC）：以TiO₂、ZrO₂等金屬氧化物為介質(zhì)，對磷酸化肽段的吸附特異性更強(qiáng)，能有效去除非磷酸化肽段干擾；
3. 磷酸化抗體親和富集：針對Ser/Thr/Tyr磷酸化位點(diǎn)的特異性抗體，可精準(zhǔn)富集對應(yīng)類型的磷酸化肽段，分辨率高；
4. 強(qiáng)陽離子交換色譜（SCX）：利用磷酸化肽段與非磷酸化肽段的電荷差異實(shí)現(xiàn)初步分離，常與IMAC/MOAC聯(lián)用，進(jìn)一步提升富集效率。富集后再結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行檢測。 

質(zhì)譜可精準(zhǔn)識別磷酸化肽段的特征離子（如PO₃⁻、PO₄²⁻），進(jìn)而定位磷酸化位點(diǎn)——比如判斷磷酸基團(tuán)連接在Ser、Thr還是Tyr上，同時(shí)量化不同生理狀態(tài)下的磷酸化水平變化。目前，質(zhì)譜技術(shù)已能實(shí)現(xiàn)對大規(guī)模磷酸化位點(diǎn)的高通量鑒定，助力我們解析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制。

• 研究意義

磷酸化異常與多種疾病密切相關(guān)，比如癌癥中蛋白激酶過度激活，導(dǎo)致信號通路紊亂，引發(fā)細(xì)胞異常增殖；糖尿病中胰島素受體的磷酸化異常，會(huì)影響胰島素信號傳導(dǎo)。通過質(zhì)譜研究磷酸化修飾，可篩選疾病相關(guān)的磷酸化標(biāo)志物，為靶向藥物研發(fā)（如激酶抑制劑）提供重要靶點(diǎn)。

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02-乙�；�修飾：基因表達(dá)的“調(diào)光器”

乙�；�主要參與基因表達(dá)調(diào)控和代謝過程，被譽(yù)為“基因表達(dá)的調(diào)光器”，它通過改變?nèi)旧�質(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)也能調(diào)控代謝酶的活性，維持細(xì)胞的代謝穩(wěn)態(tài)。

• 修飾機(jī)制

• 質(zhì)譜研究要點(diǎn)

乙�；�肽段的質(zhì)量會(huì)因乙酰基的引入而增加42 Da（乙�；�的分子量），這是質(zhì)譜識別乙�；�修飾的關(guān)鍵特征。常用富集方法以免疫親和富集為主，具體包括：

1. 乙�；�賴氨酸特異性抗體富集：最常用的方法，利用抗乙�；�賴氨酸（Ac-Lys）的單克隆/多克隆抗體，特異性結(jié)合乙酰化肽段，能高效富集不同蛋白來源的乙�；�肽段，適配組蛋白與非組蛋白乙�；�研究；
2. 染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜（ChIP-MS）：針對組蛋白乙�；�修飾，先通過組蛋白抗體沉淀染色質(zhì)復(fù)合物，再酶解富集乙酰化組蛋白肽段，精準(zhǔn)定位組蛋白乙�；�位點(diǎn)；
3. 親和標(biāo)簽純化富集：若研究目標(biāo)蛋白的乙�；�，可通過融合標(biāo)簽（如Flag、HA）純化目標(biāo)蛋白，再富集其乙�；�肽段，減少雜蛋白干擾。富集后通過LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行檢測，質(zhì)譜可精準(zhǔn)定位乙�；�位點(diǎn)（明確修飾在哪個(gè)Lys殘基上），同時(shí)量化乙�；�水平的動(dòng)態(tài)變化，尤其適用于組蛋白乙�；�的高通量研究——比如篩選不同病理狀態(tài)下，與基因表達(dá)異常相關(guān)的乙�；�位點(diǎn)。

• 研究意義

乙�；�異常與癌癥、神經(jīng)退行性疾�。ㄈ绨�爾茨海默�。�、心血管疾病等密切相關(guān)。例如，組蛋白乙�；�異常會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄紊亂，引發(fā)腫瘤發(fā)生；非組蛋白p53的乙�；�可增強(qiáng)其抑癌功能。HDAC抑制劑已應(yīng)用于癌癥治療，而質(zhì)譜研究可為這類靶向藥物的研發(fā)提供重要支撐。

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03-泛素化修飾：蛋白質(zhì)的“命運(yùn)標(biāo)簽”

泛素化與蛋白質(zhì)的降解、信號傳導(dǎo)密切相關(guān)，被譽(yù)為“蛋白質(zhì)的命運(yùn)標(biāo)簽”，它通過給蛋白質(zhì)貼上“泛素分子”標(biāo)簽，決定蛋白質(zhì)的降解或信號傳導(dǎo)，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。

• 修飾機(jī)制

泛素化是一個(gè)復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，需要泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）三步協(xié)同作用，將泛素（一種小分子蛋白質(zhì)）共價(jià)連接到靶蛋白的賴氨酸（Lys）殘基上。該過程可被去泛素化酶（DUBs）逆轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控。  
值得注意的是，泛素本身還可被進(jìn)一步泛素化，形成不同連接方式的泛素鏈，像“摩斯密碼”一樣傳遞不同信號：比如K48連接的多聚泛素鏈，會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)被蛋白酶體識別并降解（細(xì)胞內(nèi)主要的“垃圾處理”系統(tǒng)）；K63連接的多聚泛素鏈，則主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)和自噬等過程；單泛素化則主要調(diào)控蛋白質(zhì)的定位和活性。

• 質(zhì)譜研究要點(diǎn)

泛素化修飾的質(zhì)譜研究難度較大，核心挑戰(zhàn)是“泛素鏈的多樣性”和“修飾肽段的復(fù)雜性”，泛素分子本身有7個(gè)賴氨酸殘基，可形成多種連接類型的泛素鏈，且泛素化肽段的分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。泛素化肽段的常用富集方法包括：

1. 泛素鏈特異性抗體富集：核心方法，利用針對泛素分子或特定泛素鏈（如K48、K63連接）的特異性抗體，免疫沉淀泛素化蛋白/肽段，能精準(zhǔn)富集不同連接類型的泛素化修飾產(chǎn)物；
2. 親和標(biāo)簽富集：通過基因工程給泛素或目標(biāo)蛋白添加融合標(biāo)簽（如His、Flag、Myc），利用標(biāo)簽純化（如Ni-NTA親和色譜）富集泛素化蛋白復(fù)合物，再酶解獲得泛素化肽段，特異性高、雜蛋白干擾少；
3. 去泛素化酶輔助富集：利用去泛素化酶（DUBs）的特異性切割作用，將泛素鏈從靶蛋白上切割，同時(shí)保留靶蛋白上的甘氨酸殘基（泛素殘留標(biāo)記），再通過針對甘氨酸標(biāo)記的抗體富集泛素化肽段，提升位點(diǎn)鑒定準(zhǔn)確性。

 
富集后利用LC-MS/MS技術(shù)結(jié)合特異性酶解，分析泛素鏈的連接類型和靶蛋白的修飾位點(diǎn)，質(zhì)譜可精準(zhǔn)識別泛素化肽段的特征片段離子，明確泛素鏈的連接方式（如K48、K63連接），同時(shí)定位靶蛋白的泛素化位點(diǎn)，為解析蛋白質(zhì)的降解機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路提供關(guān)鍵依據(jù)。

• 研究意義

泛素化異常會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而引發(fā)多種疾病——比如癌癥中，腫瘤抑制蛋白的泛素化異常降解，會(huì)導(dǎo)致其抑癌功能喪失；神經(jīng)退行性疾�。ㄈ缗两鹕��。┲校�異常泛素化的蛋白質(zhì)會(huì)聚集形成包涵體，損傷神經(jīng)細(xì)胞。此外，泛素化相關(guān)酶抑制劑在自身免疫性疾病治療中也顯示出顯著效果，質(zhì)譜研究為這類疾病的機(jī)制解析和藥物研發(fā)提供了重要支撐。

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04-甲基化修飾：精細(xì)而穩(wěn)定的“遺傳標(biāo)記”

甲基化主要參與表觀遺傳調(diào)控和蛋白質(zhì)功能調(diào)控，是一種“精細(xì)而穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記”，它不改變蛋白質(zhì)的電荷，卻能通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用，且修飾狀態(tài)相對穩(wěn)定，可參與長期的生命調(diào)控過程。

• 修飾機(jī)制

在甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferases）的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基（-CH₃）連接到靶蛋白的賴氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）殘基上。與乙酰化不同，甲基化不改變氨基酸的電荷，且同一賴氨酸殘基可被單甲基化、二甲基化或三甲基化，不同的甲基化程度會(huì)傳遞不同的調(diào)控信號。  
其核心功能是“精細(xì)的表觀遺傳調(diào)控”：比如組蛋白H3第4位賴氨酸的三甲基化（H3K4me3），通常是基因激活的標(biāo)志；而組蛋白H3第9位或第27位賴氨酸的三甲基化（H3K9me3、H3K27me3），則是基因抑制的標(biāo)志。此外，甲基化的氨基酸還可被特定的“閱讀器”蛋白識別，招募不同的蛋白復(fù)合物來執(zhí)行調(diào)控功能。

• 質(zhì)譜研究要點(diǎn) 

甲基化修飾的質(zhì)譜研究核心是“區(qū)分甲基化程度”，即單甲基化、二甲基化、三甲基化（分別增加14 Da、28 Da、42 Da），需要高分辨率質(zhì)譜才能精準(zhǔn)區(qū)分。特異性富集分離甲基化肽段的常用富集方法包括：

1. 甲基化賴氨酸/精氨酸抗體富集：針對不同甲基化修飾（如單甲基化Lys、三甲基化Lys、精氨酸甲基化）的特異性抗體，能精準(zhǔn)富集對應(yīng)類型的甲基化肽段，適配組蛋白與非組蛋白甲基化研究，是目前最常用的富集手段；
2. 染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜（ChIP-MS）：主要用于組蛋白甲基化研究，通過組蛋白甲基化特異性抗體（如H3K4me3抗體）沉淀染色質(zhì)，再酶解富集甲基化組蛋白肽段，精準(zhǔn)定位組蛋白甲基化位點(diǎn)；
3. 親和標(biāo)簽純化富集：針對目標(biāo)蛋白的甲基化修飾，通過融合標(biāo)簽（如Flag、GST）純化目標(biāo)蛋白，再富集其甲基化肽段，減少雜蛋白干擾，提升修飾位點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性；
4. 反相高效液相色譜（RP-HPLC）：利用甲基化肽段與非甲基化肽段的疏水性差異實(shí)現(xiàn)初步分離，常與抗體富集聯(lián)用，進(jìn)一步提升富集效率。富集后再利用高分辨率LC-MS/MS技術(shù)，通過分析肽段的質(zhì)量偏差和碎片離子信息，明確甲基化位點(diǎn)、甲基化氨基酸類型（Lys或Arg）以及甲基化程度（單、二、三甲基化）。

目前，質(zhì)譜技術(shù)已能實(shí)現(xiàn)對甲基化修飾的高通量、高精度檢測，助力我們解析表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)機(jī)制。

• 研究意義 

甲基化異常與表觀遺傳疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)——比如癌癥中，組蛋白甲基化異常會(huì)導(dǎo)致原癌基因激活或抑癌基因沉默，推動(dòng)腫瘤發(fā)生；某些遺傳性疾病中，蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的突變，會(huì)導(dǎo)致甲基化修飾異常，引發(fā)發(fā)育障礙。通過質(zhì)譜研究甲基化修飾，可深入解析表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為這類疾病的診斷和治療提供新的思路。

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磷酸化的“信號開關(guān)”、乙酰化的“基因調(diào)光”、泛素化的“命運(yùn)調(diào)控”、甲基化的“表觀標(biāo)記”，四大核心修飾類型，共同構(gòu)成了蛋白質(zhì)功能調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，而質(zhì)譜技術(shù)，則為我們解鎖這個(gè)網(wǎng)絡(luò)提供了“精準(zhǔn)鑰匙”。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷升級，如更高分辨率、更高靈敏度的質(zhì)譜儀器研發(fā)、PEAKS軟件對于修飾位點(diǎn)更精準(zhǔn)更靈敏的算法等，以及與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)的整合應(yīng)用，蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)研究正進(jìn)入“高通量、高精度、高特異性”的新時(shí)代——我們不僅能批量鑒定修飾位點(diǎn)、量化修飾水平，還能解析不同修飾類型之間的協(xié)同或拮抗作用，揭示修飾異常與疾病發(fā)生的因果關(guān)系。
 

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參考文獻(xiàn)：
1. Fuseya, Y., & Iwai, K. (2021). Biochemistry, Pathophysiology, and Regulation of Linear Ubiquitination: Intricate Regulation by Coordinated Functions of the Associated Ligase and Deubiquitinase. Cells, 10(10), 2706. https://doi.org/10.3390/cells10102706
 

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