如何解決AAV 轉(zhuǎn)染實驗中由中和抗體引起的效率低

AAV由于高組織特異性、良好的擴散性、低免疫原性、高安全性和穩(wěn)定性等特點，已經(jīng)成為科研和基因治療中極具市場前景的病毒載體之一。AAV衣殼蛋白種類豐富，其中2型和9型AAV作為基因療法中的病毒載體研究較多，且已經(jīng)應(yīng)用于臨床。目前，基于AAV2載體的Luxturna（Spark Therapeutics公司開發(fā)，用于治療Leber先天性黑蒙2型）以及基于AAV9載體的Zolgensma（諾華公司開發(fā)，用于治療脊髓性肌萎縮癥）已獲批在患者身上使用，并顯現(xiàn)出較好的治療效果。

然而針對AAV衣殼的中和抗體在大多數(shù)試驗動物和人群中普遍存在，當載體進入血液中時中和抗體可阻斷AAV轉(zhuǎn)導。這些中和抗體干擾AAV進入靶細胞，從而導致轉(zhuǎn)基因在靶細胞中的表達減少，并最終降低基因治療的效率。已有研究表明，即使極低水平（滴度17:1）的NAbs也能完全消除大量病毒載體(2*10E12 vg/kg)。小鼠和非人類靈長類動物的研究表明，1:5滴度的NAbs可以完全阻止肝臟轉(zhuǎn)導。由此可見，體內(nèi)預(yù)存的抗AAV的中和抗體大大限制了AAV的應(yīng)用。因此，為提高AAV治療的有效性，提前檢測受試者或動物體內(nèi)是否存在AAV中和抗體十分必要，對臨床或臨床前試驗中AAV血清型的適用性具有指導意義。

圖1. 預(yù)存中和抗體大大降低基因轉(zhuǎn)導效率

為提高AAV治療的有效性，可提前檢測受試者或動物體內(nèi)是否存在AAV中和抗體。

利用熒光素酶報告系統(tǒng)在體外進行中和抗體的檢測，可以檢測出受試者體內(nèi)是否有特定AAV血清型的中和抗體，以方便選擇合適的動物模型或血清型，對臨床或臨床前試驗中AAV血清型的適用性具有指導性意義。

通過檢測Luciferase發(fā)光值RLU，根據(jù)發(fā)光值計算待檢樣本中抗AAV病毒的中和抗體是否存在，判斷血清/抗體對該血清型的AAV病毒是否具有中和活性。如果受試樣品中預(yù)存大量抗AAV的中和抗體，那就說明，需要更大劑量的AAV才能起到較好的基因轉(zhuǎn)導效果，那么此種血清型對該動物體來說并非理想選擇，需要更換AAV血清型或者動物模型進行下一步的研究或者臨床試驗。

數(shù)據(jù)支持
將待測樣品按以下梯度進行稀釋：30X、60X、120X、240X、 480X、960X，每個梯度取10μL分別與10μL不同血清型的AAV病毒共同孵育，孵育完成后將混合液感染293T細胞，感染24h后用酶標儀檢測RLU發(fā)光值。綜合以上，在血清1:60稀釋時，無論AAV2還是AAV9抑制率均能接近100%。
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