全自動DNA脈沖場電泳回收儀助力多組學(xué)測序文庫的構(gòu)建

干細(xì)胞自我更新和分化的精準(zhǔn)調(diào)控，是維持組織穩(wěn)態(tài)和實(shí)現(xiàn)再生的關(guān)鍵。由基因毒性應(yīng)激引發(fā)的 DNA 損傷會打破其調(diào)控平衡，導(dǎo)致分化異常（即基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化異常，GSMD），不僅直接影響干細(xì)胞功能，還可能導(dǎo)致癌癥的治療效果減弱。

干細(xì)胞的功能調(diào)控與分化中，腫瘤抑制因子 p53扮演著核心角色，被譽(yù)為 “基因組守護(hù)者”。 p53 誘導(dǎo)的長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是干細(xì)胞 DNA 損傷反應(yīng)的重要組成部分，但其對細(xì)胞可塑性和多能性的調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此，探索 lncRNA 在 GSMD 及癌癥中的作用，可為破解化療耐藥難題、推進(jìn)干細(xì)胞生物學(xué)研究提供全新方向。

日本千葉大學(xué)（Chiba University）團(tuán)隊(duì)于 2025 年 5 月 23 日在《Nature Communications》（《自然・通訊》）雜志發(fā)表了文章《p53-inducible lncRNA LOC644656 causes genotoxic stress-induced stem cell maldifferentiation and cancer chemoresistance》（《p53 誘導(dǎo)的長鏈非編碼 RNA LOC644656 導(dǎo)致基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化異常及癌癥化療耐藥》），通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）、轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)測序（ATAC-seq）、互作組分析等多組學(xué)技術(shù)，以及細(xì)胞生物學(xué)、動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí) p53 誘導(dǎo)的lncRNA LOC644656 是GSMD（基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化異常）的關(guān)鍵調(diào)控因子。

LOC644656通過與維持多能性相關(guān)的蛋白（如 POU5F1）、染色質(zhì)修飾復(fù)合物及 DNA 修復(fù)蛋白（如 DNA-PKcs）相互作用，激活轉(zhuǎn)化生長因子 -β（TGF-β）信號通路，調(diào)控 DNA 損傷反應(yīng)。LOC644656既介導(dǎo)干細(xì)胞多能性抑制與分化異常，又與癌癥化療耐藥性與不良預(yù)后相關(guān)，為克服癌癥化療耐藥及推進(jìn)干細(xì)胞生物學(xué)研究提供了潛在治療靶點(diǎn)與新方向。

實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞模型構(gòu)建：培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞（hESCs）及肝癌、乳腺癌、腎癌等多種癌細(xì)胞系，通過 5 - 氟尿嘧啶、阿霉素等藥物誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激；利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建 p53 敲除（p53KO）和 LOC644656 敲除（LOC644656KO）細(xì)胞系，同時構(gòu)建 LOC644656 誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后建立可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定克隆。
2. 多組學(xué)文庫制備與測序：提取細(xì)胞總 RNA、染色質(zhì) DNA 等樣本，分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）、轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)測序（ATAC-seq）及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）文庫。
3. Blue Pippin DNA核酸片段分選回收系統(tǒng)精準(zhǔn)篩選：ATAC-seq 與 ChIP-seq 文庫構(gòu)建完成后，采用美國Sage Science 公司的Blue Pippin 全自動核酸切膠儀進(jìn)行DNA特定片段篩選，精準(zhǔn)去除短片段。Blue Pippin可自由選擇DNA篩選片段范圍，全自動運(yùn)行，免去了切膠純化的繁瑣，比核酸片段篩選磁珠更加精準(zhǔn)可控，該步驟可去除異常DNA，富集目標(biāo)長度的 DNA 片段，獲得片段均一、純度高的高質(zhì)量測序文庫，有效提升后續(xù)測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，為解析基因表達(dá)調(diào)控及染色質(zhì)可及性特征提供關(guān)鍵保障。
4. 功能與機(jī)制驗(yàn)證：通過 RNA pull-down、RIP、Co-IP、Western blot等技術(shù)，驗(yàn)證 LOC644656 與 POU5F1、DNA-PKcs 等目標(biāo)蛋白的相互作用；利用 AlphaFold3 軟件對 LOC644656 與靶蛋白的相互作用進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模與對接模擬，明確分子作用機(jī)制。
5. 體內(nèi)外驗(yàn)證：體外通過細(xì)胞活力檢測、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，評估 LOC644656 對化療藥物敏感性的影響；構(gòu)建免疫缺陷小鼠異種移植模型，皮下注射穩(wěn)定表達(dá) LOC644656 的癌細(xì)胞，監(jiān)測腫瘤生長及對化療的耐藥性，驗(yàn)證其在體內(nèi)的功能。
6. 數(shù)據(jù)整合分析：結(jié)合基因功能（GO）分析、生存分析等生物信息學(xué)方法，整合多組學(xué)測序數(shù)據(jù)，挖掘 LOC644656 的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、臨床相關(guān)性及與癌癥預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)論
1. LOC644656 是 p53 誘導(dǎo)的 lncRNA，基因毒性應(yīng)激下在細(xì)胞核中積累，是調(diào)控 GSMD 的關(guān)鍵分子。
2. 該 lncRNA 通過直接與多能性蛋白（POU5F1 等）、KDM1A/LSD1-NuRD 抑制復(fù)合物及 DNA 修復(fù)蛋白（DNA-PKcs 等）相互作用，抑制干細(xì)胞多能性基因表達(dá)，同時激活轉(zhuǎn)化生長因子 -β（TGF-β）信號通路，驅(qū)動成纖維細(xì)胞樣分化。
3. LOC644656 可結(jié)合 DNA-PKcs 調(diào)節(jié) DNA 損傷反應(yīng)，減輕 DNA 損傷程度，抑制基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
4. 癌癥中 LOC644656 高表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，其通過抑制 DNA 損傷感應(yīng)蛋白、削弱 DNA 損傷反應(yīng)通路，增強(qiáng)癌細(xì)胞化療耐藥性。
5. LOC644656 通過協(xié)調(diào) DNA 損傷信號與分化通路，介導(dǎo)干細(xì)胞多能性抑制和基因毒性應(yīng)激抵抗，為克服癌癥化療耐藥提供了潛在治療靶點(diǎn)，也為干細(xì)胞生物學(xué)研究開辟了新方向。

更多資訊請參考原文：https://doi.org/10.1038/s41467-025-59886-w

Sage Science 公司位于美國馬薩諸塞州，2010年成立，專注于核酸領(lǐng)域的樣品制備，2萬篇文獻(xiàn)中應(yīng)用，包括眾多Nature、 Science、 Cell系列的文章，是DNA片段篩選回收領(lǐng)域的行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)。
Blue Pippin全自動DNA脈沖場電泳回收儀：
 
* 采用雙通道電泳回收專利技術(shù)， 全自動運(yùn)行；
* 高精度回收、微量樣品回收、高得率回收；
* 精準(zhǔn)回收手工切膠、磁珠法無法有效回收的 DNA 樣品；
* 用于小片段DNA篩選回收，如小RNA/small RNA文庫回收、cfDNA／ctDNA回收（循環(huán)血游離DNA／循環(huán)血腫瘤DNA）；
* 用于大片段DNA（幾kb、幾十kb甚至幾百kb）精準(zhǔn)回收，如Pacbio  HiFi文庫構(gòu)建、納米孔測序建庫、超長測序（Ultra Long Sequencing）文庫構(gòu)建等；