PacBio Kinnex 全長16S rRNA基因測序實現(xiàn)高分辨率菌群多樣性解析

在微生物組研究中，16S rRNA基因測序無疑是探索群落構成的基石。然而，傳統(tǒng)的短片段測序因其長度限制通常只能測到16S rRNA的特定區(qū)域，而非整個基因的全長序列，導致微生物種類的鑒定在部分菌屬中出現(xiàn)盲區(qū)。而今，PacBio Kinnex 全長16S rRNA試劑盒的應用徹底打破這一局面，不僅以其出色的準確性和長讀長優(yōu)勢解決了全長16S的測序難題，更借助基于MAS-Seq的Kinnex串聯(lián)技術，在Vega系統(tǒng)上單張芯片可獲得高達4000萬條高質量全長16S序列，在Revio系統(tǒng)上更可突破6000萬條，標志著全長16S測序正式步入高通量、低成本的新紀元，讓菌種甚至菌株級別的微生物組分析不再是“奢侈品”。Kinnex 全長16S測序技術基于PacBio的HiFi長讀長優(yōu)勢，實現(xiàn)對全長16S基因的精準測序，提供了一把解鎖微生物界更深層奧秘的鑰匙。

1 Kinnex 全長16S rRNA產(chǎn)品優(yōu)勢

更精準的菌群分類鑒定

長讀長可跨越16S rRNA基因的全長序列（V1-V9），能夠提供更多的信息，其不同區(qū)域的變異性可以用于區(qū)分不同的微生物菌群，使得菌群的鑒定更加精細準確，獲得菌種甚至菌株水平的群落組成注釋。

研究表明，與二代16S靶向單個到三個亞區(qū)測序的V4、V6、V1-V3、V3-V5等區(qū)域相比，V1-V9全長區(qū)域序列對菌群分類的識別注釋能力最好，不同的亞區(qū)測序均在不同的細菌類群中顯示出分類的偏差¹。

更準確的變異檢測

三代長讀長測序可覆蓋二代短讀長測序難以檢測的結構變異，同時HiFi測序的準確率可達99.9%（Q30），具有生成99.9%相似性的OTU的能力，相比對于其他方法產(chǎn)生97%相似性的OTU，PacBio較高的測序質量目前使其成為微生物菌種及菌株水平檢測的更合適的選擇²。

高性價比

Kinnex 全長16S rRNA建庫方案采用多樣品混樣和12x 16S gDNA擴增子串聯(lián)方式進行文庫構建，充分利用了HiFi測序的長讀長優(yōu)勢，大幅提升了全長16S rRNA測序的通量，降低了建庫測序的成本。

2 Kinnex 全長16S rRNA技術原理與流程

Kinnex 全長16S rRNA試劑盒采用MAS-Seq方法來提高PacBio長讀長測序的通量，其通過16S gDNA擴增子的串聯(lián)來形成長片段有序陣列。對串聯(lián)分子測序產(chǎn)生的 HiFi reads 進行生物信息學拆分，即可檢索到原始擴增子序列。Kinnex全長16S rRNA建庫流程首先使用與Kinnex Adapter兼容的帶Barcode標簽的16S基因特異性正向和反向引物進行全長16S gDNA的擴增，其中正向引物具有12種，反向引物有32種，可實現(xiàn)高達384種樣本混樣，再將擴增后的16S gDNA擴增子以12x串聯(lián)方式連接形成有序陣列，并在兩側添加接頭進行文庫構建，從而提高通量，減少測序成本，實現(xiàn)經(jīng)濟高效的全長16S rRNA基因測序。

3 Kinnex 全長16S rRNA應用案例解析

題目：Assessing the impact of diet formulation and age on targeted bacterial establishment in laboratory and mass-reared Mediterranean fruit fly using full-length 16S rRNA sequencing

研究領域：昆蟲腸道微生物

主要結果：

昆蟲腸道微生物菌群在宿主健康和與環(huán)境的相互作用中發(fā)揮著重要作用。在實驗室和大規(guī)模飼養(yǎng)的昆蟲中，腸道微生物菌群的組成和功能與野生型相比可能有所不同，而了解影響細菌在宿主中定植能力的因素對于在大規(guī)模飼養(yǎng)的昆蟲中植入曾丟失的或新的微生物菌群至關重要。在近期發(fā)表的一項關于評估飼料配方與宿主年齡對實驗室及大規(guī)模飼養(yǎng)的地中海果蠅腸道中目標細菌定植影響的研究中³，Charles J. Mason等使用不同飼料配方（液體與漿狀）對新生與7日齡果蠅進行腸桿菌菌株接種，菌株帶有抗生素抗性標記以便于追蹤，并采用PacBio Kinnex 全長16S rRNA測序進行高分辨率分析。研究結果顯示，液體飼料能高效促進目標菌株在果蠅腸道內定植，且效果不受果蠅年齡或品系來源的影響，而漿狀飼料的接種在年齡較大的果蠅中效果較差。通過全長16S測序，研究不僅成功追蹤到目標腸桿菌菌株的特定序列，還揭示了在屬級分類之下潛藏的菌株水平多樣性。與傳統(tǒng)的短片段測序相比，全長16S測序展現(xiàn)了更卓越的分辨能力，能夠清晰區(qū)分不同的腸桿菌擴增子序列變異（ASV），而這些信號在僅使用V4或V3-V4區(qū)域測序時被降低。研究揭示了利用液體飼料進行微生物干預的潛力，同時表明了PacBio全長16S rRNA測序技術在解析昆蟲微生物菌群復雜性和追蹤特定菌株方面具有顯著優(yōu)勢，為通過微生物菌群管理提升害蟲防治效果提供了新的技術路徑。

訂購信息

Kinnex 全長16S rRNA工作流程需要使用Kinnex 16S rRNA kit (103-072-100) 并參考說明書 (103-238-800) 合成16S基因特異性引物進行前期16S基因擴增和后期建庫流程。

技術的進步，正是為了打破認知的邊界。PacBio Kinnex 16S rRNA試劑盒所帶來的，并不僅僅是通量的飆升與成本的優(yōu)化，它更是一次研究范式升級的契機。它讓我們能夠以前所未有的精細度，去審視微生物世界中菌種與菌株的動態(tài)變化，推動研究從以往模糊的屬級水平向更為精細的菌種甚至菌株水平深化。

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參考文獻
1.Johnson, J.S., Spakowicz, D.J., Hong, BY. et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun 10, 5029 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13036-1.
2.Srinivas, M., Walsh, C.J., Crispie, F. et al. Evaluating the efficiency of 16S-ITS-23S operon sequencing for species level resolution in microbial communities. Sci Rep 15, 2822 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-024-83410-7.
3.Mason CJ, Nelson RC, Weaver M. et al. Assessing the impact of diet formulation and age on targeted bacterial establishment in laboratory and mass-reared Mediterranean fruit fly using full-length 16S rRNA sequencing. Microbiol Spectr 13:e02881-24. (2025). https://doi.org/10.1128/spectrum.02881-24.