瑞孚迪pHSence Eu探針ADC內(nèi)化檢測問題解答

ADC 內(nèi)化檢測

產(chǎn)品及檢測篇 Q&A

5. Q: Fab 探針是單抗還是多抗？
A: pHsence Eu 的 Fab 是多克隆抗體。因此 Fc 片段可能有多個表位被識別，若抗體存在點突 變、 Fc 端修飾，理論上來說不用擔(dān)心 Fab 的結(jié)合。但為了確保萬無一失，客戶需要進行測試 來確認這一點。

6. Q: pHsense Eu Fab anti-human IgG Fab 的分子量？
A: ~ 50KDa

7. Q：探針 PKa 是多少？
A: pH~6

8. Q: pHsense Eu 探針的效期？
A: 12 months (pHSense Eu Fab anti-Human lgG； pHSense Eu Fab anti-mouse IgG2)

9. Q：抗體/ADC 和探針孵育時該注意什么？
A: Dose response assay 中，建議以最高濃度點與 pHsense Fab-Eu 孵育（室溫孵育 30min）， 后梯度稀釋。

10. Q：儀器參數(shù)如何設(shè)置？
A: 可參照《pHSense™ setup recommendations for Revvity microplate readers》進行參數(shù)設(shè)置。

大多數(shù)情況下酶標(biāo)儀 TRF 模式按推薦參數(shù)設(shè)置可以滿足檢測需求。因選用的抗體、濃度及培養(yǎng) 體系不同， Delay 時間可以適當(dāng)延長以減少非特異性信號。

11. Q: 如何分析待測樣本探針信號隨孵育時間增加而增強？
A: 實驗孔探針信號增強主要來自兩個方面： 信號隨內(nèi)吞量增加而增強； 信號隨內(nèi)吞進展 pH 降 低而增強。另外，若長時間培養(yǎng)，培養(yǎng)基酸化會導(dǎo)致背景信號增加， 因此，對于不同濃度的待 測抗體均需設(shè)置對應(yīng)的 Fab only 對照，以便扣除背景得到特異性信號。

12. Q: 能判斷內(nèi)吞不同階段嗎？
A: 不能。信號來自整個孔當(dāng)中，所有細胞上抗體不同內(nèi)吞階段的 mix。后續(xù)將推出僅在晚期內(nèi) 體及溶酶體中特異發(fā)光的探針。

13. Q: 探針會透膜自發(fā)進入細胞內(nèi)嗎？
A: 不會自發(fā)透膜�？赏ㄟ^ Fab only 組扣除背景。

14. Q: 探針被內(nèi)吞進入溶酶體中后會被排出造成信號降低嗎？
A: 探針的熒光強度與 pH 值有關(guān)。如果探針被排泄到比溶酶體酸性更小的腔室中， 將觀察到信 號的減少。

15. Q: 若細胞數(shù)量少，細胞在每個孔的位置不一致，會影響結(jié)果嗎？
A: 酶標(biāo)儀為單孔多點數(shù)據(jù)， 能避免位置因素影響。另外，建議均勻種板。

16. Q: 多次讀數(shù)會有污染風(fēng)險， 怎么解決？
A: 讀數(shù)前可使用靜電吸附膜貼膜（推薦貨號： 64TOPSAPRO-50，免撕透光， 兼容 TRF 檢測）。 17. Q: 貼壁細胞可以不用貼壁過夜，直接加探針抗體混合物孵育后檢測嗎？

A: 通常貼壁細胞需要過夜貼壁以維持正常的生理狀態(tài)。若通過對比實驗，確定貼壁細胞懸浮狀 態(tài)不影響細胞抗原表達及內(nèi)吞狀態(tài)， 就可以直接添加探針抗體混合物。

18. Q: 有無做過血清容忍度測試？高血清檢測是否會影響數(shù)據(jù)？
A: 一般細胞培養(yǎng)的血清含量(小于等于 20%) 不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。且在相同培養(yǎng)基質(zhì)中獲

得的數(shù)據(jù)是完全可以比較的。