流式實(shí)驗(yàn)避坑指南：非特異性結(jié)合的成因與預(yù)防

眾所周知，抗原抗體反應(yīng)是特異性結(jié)合的，諸多利用抗原抗體反應(yīng)原理的實(shí)驗(yàn)例如ELISA、WB、IF、IHC、IP等均是建立在抗原抗體反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)上的，為了達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，降低非特異性吸附以提升檢測(cè)效果和可信度成為實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)之一。流式實(shí)驗(yàn)作為抗體應(yīng)用范圍之一，非特異性吸附的降低也十分重要，下面我們一起了解下流式實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的非特異性結(jié)合原因和解決辦法。

一、流式抗體使用過(guò)量

流式抗體使用濃度過(guò)高時(shí)，由于過(guò)高的使用濃度會(huì)大大提高非特異性結(jié)合的概率，這個(gè)在其他抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中也是很常見(jiàn)的非特異性結(jié)合原因。在使用抗體時(shí)，建議按照廠家的推薦使用濃度使用，也可以根據(jù)自身樣本和實(shí)驗(yàn)需求，摸索最合適的抗體使用濃度以達(dá)到最佳使用效果。同時(shí)注意，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能增加非特異性結(jié)合的概率哦，最好參考廠家指導(dǎo)的孵育時(shí)間。

二、非特異性黏附

抗體或染料分子可能通過(guò)疏水作用或靜電吸附與細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架成分或其他蛋白非特異結(jié)合，這種黏附基本不分樣本不分蛋白。因此，在樣本洗滌液、封閉液或者抗體孵育液中通常含有胎牛血清或者BSA，以封閉這些位點(diǎn)盡量降低流式抗體非特異性黏附的可能。

三、Fc受體結(jié)合

許多免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞）表面表達(dá)Fcγ受體，能與抗體的Fc段結(jié)合，導(dǎo)致抗體“粘”在非目標(biāo)細(xì)胞上，這是檢測(cè)免疫細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生大量假陽(yáng)性的重要原因。因此需要在加入熒光抗體前，使用過(guò)量非特異性同源免疫球蛋白（如人用小鼠血清、人Fc阻斷劑、商品化Fc阻斷劑）或抗CD16/32抗體（針對(duì)小鼠樣本）封閉樣本的FC結(jié)合位點(diǎn)，降低因此產(chǎn)生的大量非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

四、抗體特異性不足

若流式抗體本身未經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證，特異性不足，可能會(huì)識(shí)別非目標(biāo)抗原，那也會(huì)因此導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，選擇經(jīng)過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證的特異性抗體對(duì)于實(shí)驗(yàn)尤為重要，尚恩生物采用國(guó)內(nèi)外高分文獻(xiàn)的克隆號(hào)抗體，抗體特異性、靈敏度、穩(wěn)定性有據(jù)可查，從根源上保障實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，結(jié)果更可信。

五、熒光標(biāo)記物結(jié)合

某些熒光染料（尤其是串聯(lián)染料，如PE-Cy7、APC-Cy7）在光照或固定后易分解，產(chǎn)生游離的Cy染料，這些染料會(huì)非特異結(jié)合到任何蛋白上。因此在使用此類染料時(shí)應(yīng)注意保存時(shí)間和溫度，如果可能的話盡量避免使用這種染料。尚恩生物提供流式抗體配色服務(wù)，由深耕流式領(lǐng)域十余年的資深技術(shù)為您提供最佳流式抗體配色服務(wù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。

六、洗滌不充分

洗滌液配方、洗滌次數(shù)、時(shí)間等也會(huì)一定程度影響非特異性吸附的產(chǎn)生，通過(guò)增加洗滌次數(shù)、時(shí)間并使用合適的洗滌緩沖液，可以有效去除未結(jié)合的抗體，從而減少非特異性結(jié)合的影響。

七、死細(xì)胞影響

細(xì)胞死亡后會(huì)產(chǎn)生粘性物質(zhì)，主要是泄露的DNA等物質(zhì)可能吸附流式抗體導(dǎo)致假陽(yáng)性。因此，在流式實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用活性高的新鮮組織或樣本，可以結(jié)合流式抗體熒光類型，選擇合適的細(xì)胞死活染料（Live/Dead dye） 在表面染色前進(jìn)行標(biāo)記，并在分析時(shí)將其排除。

▲SNK-028 SUNNCELL ® Violet 510(死活染料)

八、固定破膜過(guò)程

部分細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，由于抗原存在于細(xì)胞內(nèi)部，因此需要進(jìn)行細(xì)胞固定和破膜以實(shí)現(xiàn)流式抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部檢測(cè)，但固定破膜過(guò)程會(huì)暴露細(xì)胞內(nèi)部大量非靶標(biāo)抗原，因此直接檢測(cè)會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)背景升高的問(wèn)題，因此大多會(huì)在破膜后使用含 permeabilization buffer（如含saponin）的洗滌/孵育緩沖液，并在需要的情況下在破膜后增加一步封閉。

▲SNAR-004 胞內(nèi)因子固定破膜劑 (即用型)

尚恩生物流式抗體產(chǎn)品采用國(guó)內(nèi)外高分文獻(xiàn)同樣克隆號(hào)的抗體為原料，進(jìn)口熒光染料通過(guò)優(yōu)化工藝高效標(biāo)記，有效保障了流式抗體特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度等基礎(chǔ)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性、認(rèn)可度都同時(shí)得到保障，實(shí)際使用效果不差于進(jìn)口品牌的同類產(chǎn)品。同時(shí)，尚恩生物提供的不僅僅是流式抗體產(chǎn)品，相應(yīng)的專業(yè)配色、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析等全流程指導(dǎo)服務(wù)同步在線，有效保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。從產(chǎn)品到服務(wù)，尚恩生物均為您提供最佳選擇，歡迎選購(gòu)。