冷凍電鏡技術(shù)是什么？原理、應(yīng)用與發(fā)展深度解讀

冷凍電子顯微鏡（Cryo-electron microscopy，簡稱Cryo-EM）是指對冷凍樣品進(jìn)行電子顯微鏡觀察的技術(shù)。其目的是盡可能觀察樣品接近天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。該技術(shù)特別適用于含水樣品，因此已成為研究生物樣本的重要工具。

一、發(fā)展背景與挑戰(zhàn)

冷凍電子顯微鏡的誕生經(jīng)歷半世紀(jì)之久。20世紀(jì)30年代，在Ernst Ruska研制出第一臺電子顯微鏡后不久，Ladislaus Marton意識到，使用這種儀器研究生物樣品時(shí)，“有機(jī)細(xì)胞會因強(qiáng)烈的電子轟擊而遭到破壞”。他提出，需要開發(fā)新的樣品制備技術(shù)，例如對樣品進(jìn)行冷卻。20世紀(jì)50年代，Humberto Fernández-Morán首次進(jìn)行了低溫電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)，但樣品在冷凍過程中因形成冰晶而受到損傷。20世紀(jì)70年代中期，Taylor和Glaeser發(fā)現(xiàn)，冷卻樣品可提高其對輻射損傷的耐受性。然而，直到20世紀(jì)80年代，Jacques Dubochet找到了一種不產(chǎn)生冰晶的樣品冷凍方法，現(xiàn)代低溫電子顯微鏡才真正誕生。
冷凍電鏡技術(shù)主要面臨三個挑戰(zhàn)。

1. 在樣品制備、轉(zhuǎn)移至顯微鏡以及在顯微鏡中觀察過程中，需要保持樣品處于低于-140°C的低溫狀態(tài)。
2. 電子束敏感性。即使在冷凍條件下，樣品也極易受到電子束輻射的損傷，因此透射電鏡（TEM）通常采用低劑量條件成像，掃描電鏡（SEM）則采用低電壓成像。
3. 在冷凍透射電鏡中，信號來源于電子束與樣品的直接相互作用，卻沒有使用重金屬染色來增強(qiáng)對比度，由于信噪比（SNR）較差，導(dǎo)致成像質(zhì)量不高。

二、實(shí)驗(yàn)流程


冷凍電鏡首先通過超低溫冷凍技術(shù)固定生物大分子或材料，利用透射電子顯微鏡（TEM）觀測其三維結(jié)構(gòu)。其核心原理可概括為以下三步：
1、低溫固定：將含水樣品（如蛋白質(zhì)溶液、細(xì)胞組織）快速浸入-196℃的液氮冷卻乙烷中，數(shù)毫秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)“玻璃化凍結(jié)”——避免傳統(tǒng)冷凍導(dǎo)致的冰晶損傷，，而是轉(zhuǎn)化為無定形的玻璃態(tài)冰，完美鎖定樣品的天然構(gòu)象。
2、電子成像：在液氦溫度（4.3K）或液氮溫度（77K）下，電子束穿透樣品形成二維投影圖像。由于生物分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需從數(shù)百至上百萬張不同角度的投影圖中提取信息。
3、三維重構(gòu)：利用計(jì)算機(jī)算法對數(shù)千張不同角度的二維圖像進(jìn)行分類、對齊與平均處理，通過迭代重投法、自適應(yīng)建模等技術(shù)，反向推算出樣品的三維結(jié)構(gòu)模型。如今，該技術(shù)已能實(shí)現(xiàn) 1.8Å的近原子分辨率（1Å=0.1 納米），清晰呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈、核酸的堿基配對等細(xì)節(jié)。

三、冷凍電鏡分析技術(shù)

近年來，“冷凍電鏡”這一術(shù)語僅被用于指代冷凍透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。然而，冷凍電鏡實(shí)際上還包括兩種被廣泛使用的技術(shù)——單顆粒分析（SPA）與冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）。
那么需要關(guān)注的是，我需要采用單顆粒分析還是冷凍電子斷層掃描呢？

單顆粒分析（SPA）技術(shù)針對純化后的生物大分子（如蛋白質(zhì)、病毒、核酸復(fù)合物），利用其在溶液中隨機(jī)取向的特性，采集數(shù)十萬甚至數(shù)百萬張單顆粒二維投影圖像，通過計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行分類、對齊與三維重構(gòu)，最終獲得高分辨率三維結(jié)構(gòu)。該技術(shù)無需樣品結(jié)晶，僅需微量純化樣品即可實(shí)現(xiàn)解析，尤其適用于異質(zhì)性強(qiáng)、難結(jié)晶的大分子復(fù)合物。 優(yōu)勢：

• 解析生物大分子的分辨率最高可達(dá)原子級（~1-3Å）。
• 樣品受總輻射值小。
• 對稱顆粒的解析分辨率更高，是獲取其精細(xì)結(jié)構(gòu)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
• 適合分子量大的樣品。分子量越大，結(jié)果越好。

冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）類比醫(yī)院電腦斷層掃描斷層掃描技術(shù)，通過旋轉(zhuǎn)樣品臺（傾斜角度范圍-60°至+60°），對冷凍后的細(xì)胞、組織或原位樣品進(jìn)行多角度二維成像，獲取40-60張不同角度的投影圖，再基于“中心截面定理”進(jìn)行三維重構(gòu)，形成樣品的三維斷層圖像。結(jié)合子斷層圖像平均法（STA），分辨率最高可達(dá)3Å，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)原位生物大分子的結(jié)構(gòu)觀測。該技術(shù)通常應(yīng)用于細(xì)胞層面的研究，用于分析細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及其相互之間的關(guān)系，并可應(yīng)用于完整的小型樣品（如細(xì)菌）的觀察。對于較大較厚的樣品，則需要進(jìn)行切片減薄處理。該技術(shù)的重要性在于，它能夠在細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境中揭示分子結(jié)構(gòu)的真實(shí)形態(tài)。
優(yōu)勢：

• 保存原始空間背景，直接展示目標(biāo)分子在細(xì)胞原生環(huán)境(原位)中的真實(shí)狀態(tài)、位置和與其他細(xì)胞器的空間關(guān)系。
• 作為一種"無假設(shè)"的觀測方法，可以在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)或已知分子的未知組裝形式。
• 簡單直接，對樣品的要求較低。

四、Cryo-EM在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的應(yīng)用

1.新冠病毒刺突蛋白的動態(tài)構(gòu)象
清華大學(xué)李賽團(tuán)隊(duì)與浙江大學(xué)李蘭娟團(tuán)隊(duì)合作解析出新冠病毒全病毒三維結(jié)構(gòu)（見圖2），對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育、分子動力學(xué)模擬等具有十分重要作用，為疫苗設(shè)計(jì)提供了關(guān)鍵依據(jù)。
2.噬藻體A4的侵染機(jī)制
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)周叢照團(tuán)隊(duì)解析了侵染模式藍(lán)藻魚腥藻PCC 7120的肌尾噬藻體A-1（L）尾部機(jī)器的完整三維結(jié)構(gòu)，揭示了噬藻體A-1（L）與其特異性宿主藍(lán)藻相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。有助于深入理解噬藻體與宿主藍(lán)藻相互作用的分子機(jī)制，為將來開發(fā)環(huán)境友好型底盤噬藻體奠定理論基礎(chǔ)。
3.阿爾茨海默病 tau 蛋白的聚集體結(jié)構(gòu)
英國利茲大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)掃描了阿爾茨海默病患者的死后腦組織，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者大腦中的β-淀粉樣蛋白中存在混合的微觀絲狀結(jié)構(gòu)，稱為纖維絲，以及其他結(jié)構(gòu)。為揭示阿爾茨海默病的發(fā)展機(jī)制提供了方向。并且還能啟示科學(xué)家用于分析其他神經(jīng)退行性疾病的根本原因。



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