腺相關(guān)病毒/AAV包裝系統(tǒng)的介紹與腺相關(guān)病毒包裝流程

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus）屬于細(xì)小病毒科，Dependoparvovirus屬，是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)包膜的單鏈DNA缺陷型病毒，它的生命周期依賴于復(fù)制病毒的參與，如腺病毒和單純皰疹病毒。野生型的腺相關(guān)病毒可以定點(diǎn)整合到人類第19號(hào)染色體的AAVS1位點(diǎn)，而重組腺相關(guān)病毒由于缺少整合和復(fù)制必需的兩個(gè)基因而無(wú)法整合。因此，重組腺相關(guān)病毒主要以游離于染色體的附加體形式存在，并可長(zhǎng)時(shí)間存在于非分裂細(xì)胞中。另外，腺相關(guān)病毒具有高組織特異性、良好的擴(kuò)散性、低免疫原性、高安全性和穩(wěn)定性�；�于以上特點(diǎn)，重組腺相關(guān)病毒已經(jīng)成為科研和基因治療中具市場(chǎng)前景的病毒載體之一。

腺相關(guān)病毒/AAV包裝系統(tǒng)
AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System）可以在無(wú)輔助病毒的條件下生產(chǎn)出重組腺相關(guān)病毒。這種系統(tǒng)利用已經(jīng)明確與調(diào)節(jié)AAV復(fù)制和表達(dá)的腺病毒基因產(chǎn)物，并且將這些基因產(chǎn)物通過(guò)轉(zhuǎn)染引進(jìn)宿主細(xì)胞。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、Rep/Cap質(zhì)粒）組成，利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行rAAV的生產(chǎn)。包裝細(xì)胞反式提供AAV的結(jié)構(gòu)蛋白Cap及功能蛋白R(shí)ep，在包裝輔助質(zhì)粒Adv-Helper的幫助下，高效地將帶有ITR的目的DNA片段包裝到rAAV病毒顆粒中。

圖1. AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)

腺相關(guān)病毒/AAV包裝流程
首先，將外源基因克隆進(jìn)入腺相關(guān)病毒載體，將攜帶外源基因的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/capVector共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T，轉(zhuǎn)染72h后細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的重組病毒。分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，用PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，裂解細(xì)胞沉淀收毒，合并從細(xì)胞沉淀和上清中得到的病毒。接下來(lái)，對(duì)收集的病毒進(jìn)行純化濃縮，滴度、純度檢測(cè)。

圖2. AAV從頭合成流程

腺相關(guān)病毒/AAV純化
采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對(duì)AAV病毒進(jìn)行純化。碘克沙醇是一種造影劑，已接受了臨床檢驗(yàn)。它具有非離子型、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒和代謝惰性等優(yōu)點(diǎn)�，F(xiàn)在在病毒純化方面應(yīng)用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶。

圖3. AAV病毒純化前后的示意圖

腺相關(guān)病毒/AAV滴度檢測(cè)
通過(guò)QPCR的方法來(lái)檢測(cè)AAV病毒滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。其原理是用腺相關(guān)病毒基因組特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。在定量曲線的線性范圍內(nèi)，Ct值與已知拷貝數(shù)質(zhì)粒的Ct值的比值即為病毒基因組的初始拷貝數(shù)。

圖4. AAV-GFP滴度的檢測(cè)結(jié)果

腺相關(guān)病毒/AAV純度檢測(cè)
AAV純度可以通過(guò)靈敏的銀染方法進(jìn)行檢測(cè)。AAV衣殼蛋白含有3種亞基VP1（82kDa）、VP2（72kDa）、VP3（62kDa），且所占比例為VP1：VP2：VP3=1:1:10。因此，一個(gè)純度高的AAV在SDS-PAGE分析時(shí)僅顯示三條帶。

圖5. 純化后AAVs的銀染結(jié)果