長期透析造成腹膜纖維化的機制研究
研究背景
腹膜纖維化是終末期腎病患者接受腹膜透析（PD）時面臨的主要臨床挑戰(zhàn)，長期腹膜透析導致患者的腹膜間皮細胞衰老，但其潛在機制尚未完全闡明。近期南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院周麗麗、艾軍教授團隊聯(lián)合中山大學附屬第五醫(yī)院王成教授團隊在Military Medical Research (IF 22.9)上發(fā)表文章“β-catenin initiates peritoneal fibrosis by triggering mitochondrial fission-mediated mesothelial cell senescence fate transition”，發(fā)現(xiàn)β-catenin-Drp1-TGF-β1軸是腹膜纖維化發(fā)生和進展的關鍵介質(zhì)。
· 維真助力 - AAV·
病毒產(chǎn)品：AAV1-CMV-Cre-GFP；AAV1-control
實驗動物：8周齡雄性β-cateninloxP/loxP小鼠
注射方式：腹腔注射
注射量：1× 10^11 vg/g
蛋白印跡和免疫熒光證實AAV1-Cre成功敲除β-連環(huán)蛋白
結果展示
1. β-連環(huán)蛋白誘導的線粒體裂變導致間皮細胞衰老
作者發(fā)現(xiàn)長期PD患者的腹膜間皮細胞發(fā)生衰老，并且間皮細胞中的β-連環(huán)蛋白和TGF-β信號傳導增加。作者進一步研究了間皮細胞衰老的關鍵機制，發(fā)現(xiàn)在長期PD患者組中，間皮細胞中β-連環(huán)蛋白、細胞衰老信號傳導和TGF-β的產(chǎn)生增加，并伴隨著與線粒體分裂相關的基因的上調(diào)。此外透射電子顯微鏡觀察到長期PD導致間皮細胞中碎片化的線粒體增加；染色結果顯示間皮細胞中的Drp1和mtROS增加；蛋白質(zhì)印跡分析顯示線粒體輸入受體亞基TOM20同源物、線粒體外膜標記物減少，Drp1上調(diào)；共染色顯示間皮細胞層mtROS產(chǎn)生和Drp1表達增加；RNA測序顯示β-連環(huán)蛋白上調(diào)了多種衰老相關通路，并伴有線粒體裂變。這些結果表明β-連環(huán)蛋白誘導間皮細胞衰老和線粒體分裂，從而參與細胞衰老過程。機制研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白促進Drp1表達，誘導間皮細胞分泌TGF-β1，激活成纖維細胞中的Smad信號通路，導致肌成纖維細胞激活和腹膜纖維化。
圖1 β-連環(huán)蛋白觸發(fā)的線粒體分裂導致間皮細胞衰老
2. 敲除間皮細胞中的β-連環(huán)蛋白可改善PDF小鼠的間皮細胞衰老
為了進一步研究β-連環(huán)蛋白在腹膜纖維化中的作用，作者使用AAV1-Cre-GFP構建了β-連環(huán)蛋白敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)PDF（腹膜透析液）處理小鼠會誘導mtROS產(chǎn)生，并導致Drp1和TGF-β1表達增加，但這些效應在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著減弱。此外PDF+AAV1-Ctrl組小鼠中發(fā)現(xiàn)Drp1和TGF-β1與β-連環(huán)蛋白強烈共定位，進一步支持β-catenin-Drp1-TGF-β1軸在腹膜損傷中的關鍵作用。作者進一步評估了細胞衰老標志物p16INK4A和γH2AX的表達，發(fā)現(xiàn)其水平在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著降低，在PDF處理小鼠中，p16INK4A和SA-β-gal陽性細胞均顯著增加，但在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著減少。這些結果證明β-連環(huán)蛋白在間皮細胞衰老中發(fā)揮著關鍵作用，并且與線粒體裂變和TGF-β1分泌密切相關。
圖2 敲除間皮細胞中的β-連環(huán)蛋白可改善PDF小鼠的間皮細胞衰老
3. Senolytic 療法可改善腹膜纖維化
作者用達沙替尼和槲皮素(D+Q)治療PDF小鼠，發(fā)現(xiàn)PDF處理小鼠表現(xiàn)出明顯的衰老表型，其特征是SA-β-gal活性升高以及p16INK4A、p53和p21表達增加，D+Q治療顯著減少了細胞衰老的標志物。組織學分析表明，D+Q治療減弱了PDF引起的腹膜厚度增加，蛋白質(zhì)印跡分析證實D+Q治療組中纖維化標志物的表達受到抑制。作者還評估了D+Q對β-catenin-Drp1-TGF-β1信號軸的影響，發(fā)現(xiàn)D+Q治療有效抑制了β-連環(huán)蛋白、MMP-7、Drp1和TGF-β1表達的上調(diào)，同時保留了Tomm20的表達。免疫染色結果表明，D+Q治療小鼠的β-連環(huán)蛋白、mtROS產(chǎn)生、Drp1和TGF-β1/α-SMA的水平受到抑制，而E-鈣粘蛋白則得到恢復。這些結果表明，細胞衰老和β-catenin-Drp1-TGF-β1通路形成了一個相互循環(huán)，加速腹膜纖維化。
圖3 Senolytic 療法可改善腹膜纖維化
實驗結論
本研究發(fā)現(xiàn)長期腹膜透析患者的腹膜透析流出物和腹膜活檢中，衰老間皮細胞增多，并且衰老間皮細胞和成纖維細胞之間出現(xiàn)更多的通訊信號，并證明間皮細胞衰老強烈促進腹膜纖維化。在機制上，β-catenin-Drp1-TGF-β1軸是腹膜纖維化發(fā)生和進展的關鍵介質(zhì)。這為理解腹膜纖維化的機制提供了新的見解，并提供了腹膜纖維化治療的新策略。
