Pipetty 電動(dòng)移液器在牛羊副流感病毒中和試驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案在牛羊副流感病毒（牛副流感病毒3型BPIV3、羊副流感病毒3型CPIV3）中和試驗(yàn)中使用Pipetty電動(dòng)移液器，并結(jié)合該儀器精準(zhǔn)度高、操作穩(wěn)定、適配性強(qiáng)的核心優(yōu)勢(shì)，規(guī)范實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、樣品處理、血清稀釋、病毒孵育及細(xì)胞接種等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與重復(fù)性，為牛羊副流感病毒感染的血清學(xué)檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)支撐。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

通過(guò)待檢血清中的中和抗體與牛羊副流感病毒（BPIV3/CPIV3）特異性結(jié)合，抑制病毒對(duì)敏感MDBK細(xì)胞的感染和致病變作用（CPE）。利用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)控制血清稀釋比例、病毒液及細(xì)胞懸液加樣量，通過(guò)觀察細(xì)胞病變情況，采用Reed-Muench法計(jì)算血清中和抗體效價(jià)，從而判定待檢血清中是否存在特異性中和抗體及效價(jià)水平，為臨床疫病診斷和免疫效果評(píng)估提供依據(jù)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸頭；
② 臺(tái)式離心機(jī)；
③ CO₂恒溫培養(yǎng)箱；
③ 生物安全柜；
④ 倒置顯微鏡；
⑤ 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；
⑥ 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)。
 
2、試劑和材料
① 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
② 96孔U型板；
③ MDBK細(xì)胞；
④ MEM培養(yǎng)基；
⑤ FBS、馬血清；
⑥ 0.5%胰酶消化液；
⑦ 陽(yáng)性血清、陰性血清、待檢血清(血清經(jīng)56℃水浴滅活30min)；
⑧ 病毒液(50pL含50TCID50~300TCID50的病毒)。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將血液樣品以2000r/min離心5min~10min，在生物安全柜內(nèi)，使用Pipetty電動(dòng)移液器配合無(wú)菌吸頭，精準(zhǔn)吸取上層血清至無(wú)菌離心管中，避免吸入血細(xì)胞，待檢。
2、將MDBK傳代細(xì)胞用0.5%胰酶消化液消化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液分散細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞稀釋至1×10⁶個(gè)/mL~2×10⁶個(gè)/mL。使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，以每孔100μL的量精準(zhǔn)分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，形成90%~95%融合單層細(xì)胞，備用。
 
3、在生物安全柜內(nèi)，取96孔U型板，使用Pipetty電動(dòng)移液器，使用混勻模式，用MEM培養(yǎng)基將待檢血清在96孔U型板上從1:4開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，連續(xù)稀釋8個(gè)稀釋度，最終稀釋至1:512，每孔保留稀釋后的血清50μL。每份血清設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔，確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。
4、設(shè)立陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照和接毒細(xì)胞對(duì)照，每個(gè)對(duì)照設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔。檢測(cè)牛、羊血清時(shí)陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品分為:
a)檢測(cè)牛血清樣品，使用BPIV3陽(yáng)性牛血清、陰性牛血清和BPIV3作為對(duì)照;
b)檢測(cè)羊血清樣品，使用CPIV3陽(yáng)性山羊或綿羊血清、陰性山羊或綿羊血清和CPIV3作為對(duì)照。
5、使用連續(xù)分液功能向96孔U型板中每孔精準(zhǔn)加入50μL病毒液，將U型板置于37℃恒溫環(huán)境中孵育1h。
 
6、孵育結(jié)束后，在生物安全柜內(nèi)，使用Pipetty電動(dòng)移液器將樣品精準(zhǔn)接種至已制備好的MDBK單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)孔中，接種過(guò)程中避免移液器槍頭觸碰細(xì)胞層，防止損傷單層細(xì)胞。接種完成后，將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，期間每日通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
7、培養(yǎng)72h后，取出培養(yǎng)板，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并記錄每份血清各稀釋度孔的細(xì)胞病變（CPE）情況，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)CPE記為中和陽(yáng)性，出現(xiàn)CPE記為中和陰性。采用Reed-Muench法計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)，即能抑制50%細(xì)胞出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋倍數(shù)。
 
四、結(jié)果判定
1、正常細(xì)胞對(duì)照孔和陽(yáng)性血清對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)CPE出現(xiàn)；陰性血清對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，方可判定試驗(yàn)成立，結(jié)果有效。若對(duì)照孔不符合上述條件，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、被檢血清中和抗體效價(jià)≥1:4，判定為陽(yáng)性，提示被檢牛羊曾感染或接種過(guò)對(duì)應(yīng)副流感病毒，體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體；被檢血清中和抗體效價(jià)<1:4，判定為陰性，提示被檢牛羊未產(chǎn)生有效中和抗體（需結(jié)合臨床情況排除感染初期等特殊情況）。