蛋白互作五種常見技術及操作步驟
- 不同技術的功能定位存在差異：部分技術適用于靶蛋白篩選（如酵母雙雜交 Y2H），部分適用于互作驗證（如鄰近連接技術 PLA），還有部分兼具篩選與驗證雙重功能（如免疫共沉淀 Co-IP 聯(lián)用蛋白質譜可實現(xiàn)篩選，聯(lián)用 WB 則可完成驗證）。因此，篩選類技術一般用于預實驗階段的靶點確定，驗證類技術多用于明確具體分子后的功能驗證。
- 上述技術可分為細胞體系與非細胞體系（In tube）兩類：細胞體系技術更貼合生理研究背景，但易受多種干預因素影響；非細胞體系技術更易驗證蛋白間直接互作，但難以完全還原體內真實場景，且對蛋白純化操作要求更高。為確保研究結論的嚴謹性，蛋白 - 蛋白互作驗證需同時結合細胞與非細胞體系開展。
- 上述技術在國自然項目設計中存在 “必備項” 與 “加分項” 之分（觀點僅供參考），無需在方案中全面羅列，應結合研究需求合理選擇。
一、酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast Two-Hybrid System，Y2H）
- 構建融合蛋白：將目標蛋白（蛋白 X）與 BD 融合形成 “誘餌”，將待篩蛋白（蛋白 Y）與 AD 融合形成 “獵物”。
- 轉化酵母細胞：將編碼兩種融合蛋白的基因分別導入酵母細胞。
- 互作介導重組：若蛋白 X 與蛋白 Y 在酵母細胞內發(fā)生互作，其融合蛋白可使 BD 與 AD 靠近，重組為活性轉錄激活因子。
- 結果判定：活性轉錄激活因子會驅動報告基因（如 HIS3、lacZ 等）表達，通過檢測報告基因活性即可判斷蛋白間是否存在互作。
二、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）
兼具靶蛋白篩選與蛋白 - 蛋白互作驗證功能（國自然必需技術），免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）以抗體與抗原的特異性結合為核心原理，用于解析蛋白間相互作用。細胞在非變性條件下裂解時，蛋白間的生理性互作狀態(tài)可得以保留，利用靶蛋白特異性抗體進行沉淀時，與之結合的互作蛋白會隨靶蛋白共同被捕獲。
- 細胞處理：收集細胞并進行裂解，裂解液中需添加蛋白酶抑制劑以抑制蛋白降解。
- 上清獲取：細胞裂解后離心去除沉淀的細胞碎片，收集含可溶性蛋白的上清液。
- 免疫結合：加入靶蛋白特異性抗體及蛋白 A/G 偶聯(lián)磁珠（或瓊脂糖珠），于 4°C 孵育以實現(xiàn)抗體與靶蛋白的特異性結合。
- 復合物捕獲：孵育結束后離心收集結合有蛋白復合物的珠子，棄去未結合的游離蛋白。
- 非特異洗脫：用裂解緩沖液多次洗滌珠子，去除非特異性結合的雜蛋白。
- 復合物釋放：加入蛋白樣品緩沖液并煮沸珠子，使結合的蛋白復合物從抗體 - 珠子復合物上釋放。
- 結果分析：通過 SDS-PAGE 電泳分離蛋白復合物，再結合 Western blotting（驗證已知互作蛋白）或質譜分析（篩選未知互作蛋白）進行結果解讀。
三、GST 下拉實驗（GST pull-down）
- 構建攜帶 GST 標簽的融合蛋白表達載體，轉染至原核或真核表達系統(tǒng)中進行蛋白表達。
- 收集表達菌株或細胞并完成裂解操作，裂解液中需添加蛋白酶抑制劑以防止目標蛋白降解。
- 將細胞裂解物與固化有 GST 標簽蛋白或 GST 融合蛋白的瓊脂糖珠充分混合，置于 4℃條件下孵育數(shù)小時。
- 離心收集結合蛋白復合物的瓊脂糖珠，棄去未發(fā)生結合的游離蛋白組分。
- 選用適配緩沖液對瓊脂糖珠進行多次洗滌，去除非特異性結合的雜蛋白。
- 向沉淀的瓊脂糖珠中加入蛋白樣品緩沖液并煮沸，洗脫結合的蛋白復合物。
- 通過 SDS-PAGE 電泳對洗脫的蛋白復合物進行分離，結合 Western blot 技術驗證已知互作蛋白，或借助質譜分析篩選未知互作蛋白。
四、免疫熒光共定位（ImmunoFluorescence Colocalization）
- 構建目標蛋白與不同熒光蛋白的融合表達載體，轉染至宿主細胞中實現(xiàn)蛋白表達。
- 待細胞培養(yǎng)至適宜密度后，采用固定液對細胞進行固定處理，維持細胞形態(tài)與蛋白定位。
- 依據(jù)實驗需求，選用特異性熒光抗體對靶蛋白進行免疫標記（若為熒光蛋白融合表達則可省略此步）。
- 利用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行成像觀察，采集熒光信號圖像。
- 運用圖像分析軟件處理采集到的圖像，計算共定位系數(shù)，對兩種蛋白的共定位程度進行定量評估。
五、鄰近連接技術（Proximity Ligation Assay，PLA）
- 樣本制備：對細胞或組織樣本進行固定及透化處理，確保探針可有效結合靶蛋白。
- 封閉處理：對樣本進行封閉以阻斷非特異性結合位點，降低背景干擾。
- 一抗孵育：加入兩種特異性一抗，分別與兩種靶蛋白的不同表位特異性結合。
- PLA 探針孵育：加入兩種 PLA 探針（帶寡核苷酸標簽的二抗），使其與對應的一抗特異性結合。
- 連接反應：若兩種靶蛋白存在互作，結合的 PLA 探針會充分靠近，此時連接酶可將探針上的寡核苷酸連接，形成環(huán)狀 DNA 模板。
- 滾環(huán)擴增：采用 RCA 技術對環(huán)狀 DNA 模板進行擴增，生成大量串聯(lián)重復的 DNA 產物，實現(xiàn)信號放大。
- 檢測分析：加入熒光標記的探針與擴增產物結合，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號，同時完成定性判斷與定量分析。
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