Pipetty電動移液器在肝素凝血時間測定（APTT法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案針對肝素凝血時間測定（APTT 法）中移液操作的精度與效率需求，引入 Pipetty 電動移液器優(yōu)化試驗流程。其核心優(yōu)勢在于：高精度確保樣本、APTT 試劑及氯化鈣溶液移取量精準，減少人為操作導(dǎo)致的凝固時間偏差；電動驅(qū)動省力設(shè)計降低長時間操作疲勞，適配多規(guī)格吸頭滿足不同試劑移取需求；避免手工操作導(dǎo)致的人為誤差；通過該設(shè)備應(yīng)用，可顯著提升試驗重復(fù)性與結(jié)果可靠性，為肝素抗凝效果監(jiān)測提供更穩(wěn)定的技術(shù)支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       正常血漿含內(nèi)源性凝血因子，APTT 試劑中的活化劑（如白陶土）可激活內(nèi)源性途徑的 Ⅻ 因子，磷脂則彌補乏血小板血漿中血小板磷脂的不足，共同啟動內(nèi)源性凝血反應(yīng)。加入氯化鈣（復(fù)鈣）后，凝血過程持續(xù)進行，正常情況下血漿會逐漸凝固。肝素能增強抗凝血酶 Ⅲ 活性，抑制 Ⅸa、Ⅹa、Ⅱa 等關(guān)鍵凝血因子，顯著延緩該凝血進程。通過測定從加入氯化鈣到血漿出現(xiàn)纖維蛋白凝塊的時間（APTT 值），可間接反映肝素對凝血系統(tǒng)的抑制強度，從而監(jiān)測肝素抗凝效果，為臨床調(diào)整劑量提供依據(jù)。
 
二、‌實驗準備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-1000；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 玻璃試管；
④ 采血針；
⑤ 凝血分析儀。
 
2、試劑和材料
① 肝素標準品；
② 供試品；
③ 兔血漿；
④ CaCl2試劑；
⑤ APTT試劑。
 
 
三、實驗步驟
1、標準品溶液的制備：精密稱取肝素標準品適量，按標示效價加滅菌注射用水溶解使成每1mL中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存。
2、標準品稀釋液的制備：試驗當日，使用Pipetty電動移液器，精密量取標準品溶液，按高、中、低劑量組（dS₃、dS₂、dS₁）用氯化鈉注射液配制成3種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值（r）應(yīng)相等；調(diào)節(jié)劑量使低劑量組各管的平均凝結(jié)時間較不加肝素對照管明顯延長，一般以大于1.5倍空白血漿的凝結(jié)時間為宜。高劑量組各管的平均凝結(jié)時間，以不超過90秒為宜，其稀釋液一般可制成每1mL中含肝素0.4～1.7單位，r為1∶0.85左右；
 
　3、供試品溶液與稀釋液的制備：按供試品的標示量或估計效價（AT），制成高、中、低(dT₃、dT₂、dT₁）3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值（r）應(yīng)與標準品相等，供試品與標準品各劑量組的凝結(jié)時間應(yīng)相近。
　　4、血漿的制備：迅速收集兔或豬血置預(yù)先放有109mmol/L枸椽酸鈉溶液的容器中，枸椽酸鈉溶液與血液容積比為1∶9，邊收集邊輕輕振搖，混勻，室溫下1500×g離心不少于15分鐘（g為重力常數(shù)）。立即吸出血漿，并分成若干份分裝于適宜容器內(nèi)，低溫凍結(jié)貯存。臨用時置37℃±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過濾，使用過程中在4～8℃放置。
　5、取凝血分析儀樣品杯若干，使用Pipetty電動移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，每管依次加入血漿50μL、一種濃度的標準品或供試品稀釋液50μL、APTT試劑50μL，混勻，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。37℃±0.5℃預(yù)溫180秒后，每管再加入CaCl2試劑50μl，然后立即用凝血分析儀測定凝結(jié)時間，即活化部分凝血活酶時間（APTT）。標準品或供試品稀釋液每個濃度的測定次數(shù)不得少于3次，各濃度的測定次數(shù)應(yīng)相同。測定時，血漿、標準品或供試品稀釋液、APTT試劑、CaCl2試劑的加入比例和預(yù)溫時間可根據(jù)儀器或試劑的說明書適當調(diào)整。測定順序以保證標準品和供試品測定的平行性為原則，應(yīng)盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。
　　
 
四、結(jié)果判定
1、將上述方法測得的凝結(jié)時間換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的量反應(yīng)平行線測定法計算效價及實驗誤差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。