Pipetty電動(dòng)移液器在牛肺疫病原檢測（競爭ELISA）中的應(yīng)用

方案摘要：牛傳染性胸膜肺炎（Contagious Bovine Pleuropneumonia，CBPP）是由絲狀支原體絲狀亞種（Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides，Mmm）引起的一種牛屬動(dòng)物傳染病，又稱牛肺疫。以肺小葉間淋巴管漿液-滲出性纖維素性炎和漿液纖維素性胸膜炎為特征。健康牛與感染牛直接接觸后吸入感染牛的“飛沫”是本病的主要傳染途徑，其中感染牛的“飛沫”是傳播媒介，本病也可通過感染牛的精液和胚胎造成垂直傳播。本方案使用了日本進(jìn)口產(chǎn)品，Pipetty電動(dòng)移液器，通過精準(zhǔn)控制、流程優(yōu)化、人體工程學(xué)設(shè)計(jì)三大核心優(yōu)勢，系統(tǒng)性解決了競爭 ELISA 實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵痛點(diǎn)。其高精度分液能力確�？乖� - 抗體競爭比例的真實(shí)性，連續(xù)分液功能提升加樣效率與實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，而輕量化設(shè)計(jì)則兼顧實(shí)驗(yàn)人員的健康與舒適度。對于追求檢測靈敏度和通量平衡的實(shí)驗(yàn)室（如動(dòng)物疫病防控、生物醫(yī)藥研發(fā)），是提升競爭 ELISA 檢測質(zhì)量的理想工具。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      牛肺疫病原檢測（競爭 ELISA）以檢測絲狀支原體牛亞種（Mmm）抗原為目標(biāo)，核心是 “抗原競爭結(jié)合特異性抗體”。首先將抗 Mmm 特異性抗體包被在 ELISA 微孔板（固相載體）上；隨后向微孔同時(shí)加入待檢樣本與酶標(biāo)記 Mmm 抗原，二者競爭抗體的有限結(jié)合位點(diǎn)   樣本含 Mmm（陽性）時(shí)，待檢抗原會搶占更多位點(diǎn)，使酶標(biāo)抗原結(jié)合量減少，反之（陰性）則酶標(biāo)抗原大量結(jié)合。洗滌去除游離成分后加底物，酶標(biāo)抗原上的酶催化底物顯色，通過酶標(biāo)儀測吸光度（OD 值）判斷：陽性樣本因酶標(biāo)抗原少，顯色淺、OD 值低；陰性樣本顯色深、OD 值高，以此間接判定是否存在 Mmm 病原，該方法特異性強(qiáng)、抗干擾性好。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 酶標(biāo)儀；
③ 恒溫培養(yǎng)箱；
④ 振蕩器；
⑤ 洗板機(jī)。
 
2、試劑和材料
① PBS 溶液（pH 7.4）；
② 洗滌緩沖液 PBST；
③ 血清稀釋液及酶標(biāo)抗體稀釋液（簡稱稀釋液）；
④ 陽性對照血清（可由牛傳染性胸膜肺炎專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供）；
⑤ 陰性對照血清（可由牛傳染性胸膜肺炎專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供）；
⑥ 羊抗鼠 IgG 辣根過氧化物酶結(jié)合物（簡稱酶標(biāo)抗體）（商品化試劑）；
⑦ TMB（3'，3'，5'，5'-四甲基聯(lián)苯胺）底物溶液（商品化試劑）；
⑧ 終止液；
⑨ ELISA 抗原包被板（可由牛傳染性胸膜肺炎專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供）：包被有 Mmm 膜蛋白并經(jīng)過封閉處理的 96 孔 ELISA 板；
⑩ ELISA 加樣槽。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、使用前所有試劑需恢復(fù)至 18 ℃~26 ℃。試劑需輕搖或渦旋混勻，加不同樣品需更換吸頭，對照可加在微量反應(yīng)板的任何位置。
2、使用稀釋液將單抗進(jìn)行 500 倍稀釋（如：一塊板需要 12 mL，將 24μL單抗加入 11.976 mL的稀釋液）。
3、取一塊未使用的 96 孔酶標(biāo)板，使用Pipetty電動(dòng)移液器1-250量程，設(shè)置連續(xù)分液功能，設(shè)定單次分液量以及需要的孔數(shù)，按表3所示加入所需體積的稀釋液、對照、血清樣品和單抗檢測溶液。
 
4、從預(yù)反應(yīng)板的每孔吸取 100 μL， 轉(zhuǎn)移至 ELISA 抗原包被板上相應(yīng)的孔中，蓋上封口膜，置于 37 ℃孵育1h。
5、棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌緩沖液 PBST 250 μL，孵育3min，棄去 PBST，重復(fù)洗滌4次，最后一次在吸水紙上拍干。
6、使用Pipetty 5-1000量程，設(shè)置連續(xù)分液功能，每孔加入 100 μL 的酶標(biāo)二抗，置于 37 ℃孵育 45 min。
 
7、再次棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌緩沖液 PBST 250 μL，孵育3min，棄去 PBST，重復(fù)洗滌4次，最后一次在吸水紙上拍干。
8、每孔加入 100 μL TMB 底物溶液，置于 37 ℃避光孵育 10 min。
9、每孔加入 100 μL 終止液，輕微振蕩混勻后，置酶標(biāo)儀中在波長 450 nm 下讀取 OD 值（OD₄₅₀），應(yīng)在加入終止液后 5min 內(nèi)完成讀數(shù)。
四、結(jié)果判定
1、樣品抑制率（Inhibition Percentage）按照公式（1）計(jì)算：
 
式中:
IP_s                   待檢血清樣品抑制率；
OD_450-Mab             單抗對照在 450 nm 波長處的 OD 值；
OD_450-cc           二抗對照在 450 nm 波長處的 OD 值；
OD_450-S            待檢血清樣品在 450 nm 波長處的 OD 值。
2、試驗(yàn)成立條件
各組對照為如下結(jié)果時(shí)試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重復(fù)試驗(yàn):

• Mab 對照平均 OD₄₅₀應(yīng)在 0.2~2.0 之間;
• 陽性對照樣品抑制率應(yīng)在 55%~110%之間;
• 陰性對照樣品抑制率應(yīng)<40%。

3、判定
a) 陽性：IP_s>50% 判為 Mmm 抗體陽性。
b) 陰性：IP_s<50% 判為 Mmm 抗體陰性。