Pipetty電動移液器在馬流感AC-ELISA實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案意在明確Pipetty電動移液器于馬流感AC - ELISA（抗原競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）里的具體應(yīng)用流程，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作步驟，借助該移液器精準(zhǔn)、高效、能連續(xù)分液的優(yōu)點(diǎn)，降低移液誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，為馬流感病毒（EIV）抗原的快速、精確檢測提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
 
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

將 EIV 單克隆抗體包被在微孔板上，加入待檢樣品與酶標(biāo)抗體，樣品中的 EIV 抗原會與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被抗體。若樣品為陽性，競爭結(jié)合導(dǎo)致酶標(biāo)抗體無法固定，顯色淺或不顯色；若為陰性，酶標(biāo)抗體正常結(jié)合，底物顯色深。
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 酶標(biāo)儀；
③ 恒溫箱；
④ 微孔板快速振蕩器。
 
2、試劑和材料
① 陽性對照，EIV雞胚/細(xì)胞培養(yǎng)物、感染EIV的陽性組織樣品均可作為陽性對照；
② 陰性對照(PBS）；
③ 洗滌緩沖液PBST；
④ 封閉液；
⑤ 酶標(biāo)抗體稀釋液；
⑥ TMB底物溶液(商品化試劑)；
⑦ 終止液；
⑧ EIV單克隆抗體包被板；
⑨ 酶標(biāo)抗體。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將拭子樣品充分捻動、擠干后，使用Pipetty電動移液器設(shè)置連續(xù)分液功能，每次吸取總量200μL樣品液加入抗體包被板，每份樣本加2個孔，每孔100μL。每塊包被板設(shè)陰性對照和陽性對照各2孔，每孔100μL。蓋好包被板，置37°C恒溫箱內(nèi)作用30 min。
 
2、棄去孔內(nèi)液體，每孔加入PBST 250μL。孵育3min,棄去PBST,重復(fù)洗滌4次，每次拍干。
3、使用Pipetty，用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋至工作度(1μg/mL),連續(xù)分液模式，每孔加100μL，置37°C作用30min，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入PBST 250μL,孵育3min,棄去PBST,重復(fù)洗滌4次，每次拍干。
4、每孔加新配制的TMB底物溶液100μL，在22℃(±2℃)下避光反應(yīng)5min。
 
5、每孔加終止液50μL。輕微振蕩混合均勻后，置酶標(biāo)儀中，在波長為450nm 下讀取OD值(OD),應(yīng)在加入終止液后5min內(nèi)完成讀數(shù)。
 
 
四、結(jié)果判定
1、結(jié)果成立條件：陽性對照 OD_450nm>0.5;陰性對照OD_450nm≤0.1。
2、陽性：檢測樣品OD_40nm≥0.12時，判定為EIV抗原陽性。
3、陰性：待檢樣品OD450nm<0.12時，判定為EIV抗原陰性。