蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)糖基化修飾

糖蛋白質(zhì)組學(xué)（Glycoproteomics）作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要分支，聚焦于生物體內(nèi)糖基化修飾蛋白的系統(tǒng)鑒定、定量分析及功能解析，是后基因組時代生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域之一。糖基化作為最普遍且復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，指在酶的催化下，單糖或寡糖鏈共價連接到蛋白質(zhì)特定位點的過程，這層“糖衣”不僅塑造蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，更調(diào)控其生物活性、細胞定位與分子互作，貫穿胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)等幾乎所有核心生命過程，要了解這些功能，就需要知道精確的聚糖結(jié)構(gòu)，以及其結(jié)構(gòu)變異性、與蛋白質(zhì)的連接位點以及這些位點的占據(jù)程度等。

聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于細胞上，它們分別與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價結(jié)合。連接兩個單糖的鍵稱為糖苷鍵。聚糖主要通過兩種主要連接方式與蛋白質(zhì)相連，一種是聚糖通過天冬酰胺的側(cè)鏈氮與蛋白質(zhì)連接（N-連接聚糖），另一種是通過絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈氧連接（O-連接聚糖）。在N-連接糖基化的情況下，糖鏈一般與Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受體天冬酰胺結(jié)合。最常見的O-連接糖基化將單個單糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）與蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸結(jié)合，沒有比較固定的連接基序，并且在GalNAc的情況下，這種單糖會進一步延伸以形成各種核心聚糖結(jié)構(gòu)。
 
對于聚糖的全面分析主要分為兩個層次，第一個層次是僅對單個聚糖結(jié)構(gòu)及其異構(gòu)模式的詳細分析，即糖組學(xué)，需要將聚糖從糖蛋白上釋放出來，釋放的聚糖可以進入質(zhì)譜分析，也可以結(jié)合其他衍生化和分析技術(shù)，如熒光標(biāo)記、全甲基化等，進行深入的結(jié)構(gòu)表征。但由于聚糖已經(jīng)不再結(jié)合蛋白質(zhì)，所以無法研究特定于位點的信息。第二個層次是直接對糖蛋白上糖基化肽段、位點及糖型的表征，即糖蛋白質(zhì)組學(xué)，保留聚糖-多肽的完整結(jié)合（圖1）。從復(fù)雜生物樣本中測定糖、糖肽及糖鏈的結(jié)構(gòu)，可以借助核磁共振(NMR)、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)和毛細管電泳(CE)等多種不同的技術(shù)，而目前LC-MS/MS是糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究最常用的方法。
 

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糖組學(xué)分析
在糖組學(xué)分析中，使用N-聚糖切割酶從肽的天冬酰胺殘基上切割，釋放出的具有親水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等與O-連接的糖肽和非糖基化肽分離。隨后，O-連接的糖肽和非糖基化肽從C18 SPE中洗脫。由于缺乏對O-連接聚糖具有廣泛特異性的去糖基化酶，因此O-連接聚糖的釋放通常通過化學(xué)方法完成。用于釋放O-聚糖的常見化學(xué)方法包括還原性β-消除、基于氨的非還原性β-消除或肼解。為了實現(xiàn)高靈敏度檢測，O-連接和N-連接的聚糖組分在質(zhì)譜分析前通常會進行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸等進行還原端標(biāo)記。衍生化（特別是全甲基化）可增強游離聚糖的離子化效率，通過糖苷鍵斷裂和跨環(huán)斷裂，能夠從串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖中提取更詳細的結(jié)構(gòu)信息。
 

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糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析
由于糖基化修飾蛋白在生物樣本中占比極低，糖肽僅占總肽段的5%以下，且易被大量高豐度非糖肽掩蓋，直接進行質(zhì)譜分析難以實現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定，因此需先通過富集技術(shù)特異性捕獲糖肽，再結(jié)合質(zhì)譜分析解析其詳細信息。常用的富集技術(shù)各有側(cè)重，其中凝集素親和層析憑借凝集素與特定糖鏈結(jié)構(gòu)的特異性識別能力，可針對性富集含對應(yīng)糖鏈的糖肽，且操作簡便、兼容性強；親水相互作用色譜則基于糖肽與非糖肽的親疏水性差異，利用親水固定相將親水性更強的糖肽保留并分離，尤其適合富集弱酸性糖肽和短鏈糖肽，兩種技術(shù)可結(jié)合使用以提升富集效率與覆蓋面。其他方法包括免疫親和色譜法、酰肼法、硼酸法、二氧化鈦富集法等。

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質(zhì)譜：糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)
質(zhì)譜分析作為糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)解析的核心環(huán)節(jié)，分析流程主要包括樣本預(yù)處理→富集（糖/糖肽）→離子化→質(zhì)譜分離與碎裂→譜圖解析（圖5）：

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蛋白質(zhì)糖基化研究的意義

1. 揭示生命基本規(guī)律

• 糖基化廣泛參與細胞識別、信號傳導(dǎo)、細胞黏附、免疫識別、胚胎發(fā)育等核心生命過程。
• 糖鏈結(jié)構(gòu)的多樣性與時空特異性，賦予蛋白質(zhì)精細的功能調(diào)控能力，是生命復(fù)雜性的重要分子基礎(chǔ)。
• 與核酸、蛋白質(zhì)共同構(gòu)成生命信息傳遞的 “第三條分子鏈”，完善對生命本質(zhì)的認知。

2. 闡明疾病發(fā)生機制

• 許多重大疾病的發(fā)生、發(fā)展都伴隨異常糖基化，如腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病等。
• 糖基化異�？捎绊懙鞍追�(wěn)定性、定位、互作，直接參與細胞癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等過程。
• 為從分子層面解釋疾病機制提供了傳統(tǒng)蛋白組學(xué)無法覆蓋的新維度。

3. 助力疾病早診與精準(zhǔn)分型

• 糖基化修飾靈敏度高、變化早，是理想的疾病標(biāo)志物來源。
• 典型如AFP-L3（肝癌特異性糖基化異質(zhì)體），已成為臨床早期診斷與良惡性鑒別重要指標(biāo)。
• 基于糖基化譜可實現(xiàn)更精細的疾病分型、預(yù)后判斷、療效監(jiān)測，推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。

4. 推動生物醫(yī)藥創(chuàng)新

• 抗體、激素、疫苗等重組蛋白藥物的療效、半衰期、免疫原性高度依賴糖基化。
• 糖基化優(yōu)化是生物藥質(zhì)量控制與藥效提升的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
• 為靶向藥物設(shè)計、抗感染疫苗、抗腫瘤療法提供全新靶點與策略。

5. 完善生命組學(xué)體系

• 糖基化連接基因組、蛋白質(zhì)組與表型組，填補了從基因到功能的關(guān)鍵缺口。
• 糖組學(xué)、糖蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，讓生命科學(xué)從線性信息走向多維、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)化的系統(tǒng)研究。

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結(jié)語

糖組學(xué)與糖蛋白質(zhì)組學(xué)正借助質(zhì)譜技術(shù)，逐步揭示糖類分子在生命過程中的核心作用。從基礎(chǔ)科研到臨床應(yīng)用，這一領(lǐng)域不僅拓展了我們對生命本質(zhì)的認識，更為疾病診斷、藥物研發(fā)提供了新的可能性。未來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷升級和人工智能的引入，糖組學(xué)研究將迎來更廣闊的應(yīng)用前景。我們的PEAKS GlycanFinder軟件可以提供糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、全面的定性、定量分析結(jié)果，可以聯(lián)系我們深入交流，包括但不限于數(shù)據(jù)分析、實驗方案設(shè)計等。

參考文獻

1. Shajahan A, Heiss C, Ishihara M, Azadi P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 2017 Jul;409(19):4483-4505. doi: 10.1007/s00216-017-0406-7. Epub 2017 Jun 6. PMID: 28585084; PMCID: PMC5498624.
2. Bagdonaite, I., Malaker, S.A., Polasky, D.A. et al. Glycoproteomics. Nat Rev Methods Primers 2, 48 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00128-4

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