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FSEC熒光檢測(cè)尺寸排阻色譜技術(shù)的原理、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程、優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用
在細(xì)胞生命活動(dòng)中，膜蛋白扮演著不可替代的核心角色，它參與 ATP 合成、離子與分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶促反應(yīng)等幾乎所有關(guān)鍵生理過(guò)程，編碼膜蛋白的基因約占整個(gè)基因組的 30%，同時(shí)也是目前藥物研發(fā)中最主要的靶點(diǎn)類(lèi)別之一。
但長(zhǎng)期以來(lái)，膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)與功能研究始終面臨諸多技術(shù)瓶頸：膜蛋白普遍存在天然表達(dá)水平低、強(qiáng)疏水性的特點(diǎn)，且在體外純化過(guò)程中極易發(fā)生聚集、失活，難以長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的折疊狀態(tài)，這些問(wèn)題極大限制了膜蛋白研究的推進(jìn)。而熒光檢測(cè)尺寸排阻色譜（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng) FSEC）技術(shù)的出現(xiàn)，為膜蛋白研究中的各類(lèi)篩選難題提供了高效、快速的解決方案，成為當(dāng)下膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中不可或缺的核心工具。
一、FSEC 技術(shù)的核心原理
FSEC 技術(shù)是將尺寸排阻色譜（SEC）的分子篩分離能力，與高特異性的熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的分析方法。
其核心設(shè)計(jì)是將目標(biāo)研究蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行共價(jià)融合表達(dá)，通過(guò)熒光檢測(cè)器對(duì) GFP 的特異性信號(hào)進(jìn)行捕獲，無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)純化操作，就能直接、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)粗裂解液或純化過(guò)程中目的蛋白的表達(dá)水平、分布狀態(tài)與折疊情況。
在 FSEC 的層析圖譜中，我們可以通過(guò)三個(gè)核心維度讀取樣本信息：洗脫峰的峰面積直接反映目的蛋白的表達(dá)水平；洗脫峰的出峰位置與洗脫體積，可對(duì)應(yīng)計(jì)算出融合蛋白的近似分子量；而峰形與峰的分布，則直觀(guān)體現(xiàn)了目的蛋白的單分散性與折疊狀態(tài)。通常情況下，折疊正確、狀態(tài)均一、單分散性好的蛋白，會(huì)呈現(xiàn)出對(duì)稱(chēng)的高斯型洗脫峰；而發(fā)生聚集、多分散、未正確折疊或狀態(tài)不穩(wěn)定的蛋白，則會(huì)出現(xiàn)多個(gè)不對(duì)稱(chēng)的洗脫峰，或在排阻體積位置出現(xiàn)高聚集峰。
二、FSEC 技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程
FSEC 實(shí)驗(yàn)的操作流程簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的樣本前處理，核心流程如下：
1，重組表達(dá)載體構(gòu)建：將目的基因克隆至帶有 GFP 標(biāo)簽的表達(dá)載體中，可根據(jù)需求選擇原核或真核表達(dá)體系；
2，蛋白表達(dá)：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中，進(jìn)行目的融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
3，樣本制備：收集表達(dá)后的細(xì)胞，通過(guò)裂解、去垢劑增溶處理后，經(jīng)超高速離心去除不溶性雜質(zhì)，收集的上清液即可作為 FSEC 的上樣樣本；
4，色譜檢測(cè)：將制備好的樣本直接上樣至經(jīng)對(duì)應(yīng)緩沖液預(yù)平衡的 SEC 分子篩色譜柱，通過(guò)串聯(lián)的熒光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器，同步采集信號(hào)并獲得層析圖譜，完成分析。
三、FSEC 技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)
相比傳統(tǒng)的蛋白分析與篩選方法，F(xiàn)SEC 技術(shù)在膜蛋白研究中具備不可替代的優(yōu)勢(shì)，完美適配膜蛋白早期篩選的核心需求：
1，超高檢測(cè)特異性，無(wú)雜蛋白干擾
FSEC 的檢測(cè)信號(hào)僅來(lái)自于與目的蛋白融合的 GFP 標(biāo)簽，細(xì)胞內(nèi)源性的雜蛋白無(wú)對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)，因此即使是未純化的全細(xì)胞裂解液，也能精準(zhǔn)捕獲目的蛋白的信號(hào)，完全不受背景雜蛋白的干擾。
2，超高靈敏度，低樣本量即可檢測(cè)
該技術(shù)的熒光檢測(cè)靈敏度可達(dá) ng 級(jí)別，僅需幾毫升的細(xì)胞培養(yǎng)物，就能完成一次完整的檢測(cè)分析，大幅降低了樣本制備的成本與工作量，尤其適合珍貴樣本或難表達(dá)蛋白的早期篩選。
3，樣本前處理簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短
無(wú)需進(jìn)行蛋白純化、標(biāo)簽切除、樣本濃縮等繁瑣操作，細(xì)胞經(jīng)裂解、去垢劑增溶和離心除雜后，即可直接上樣檢測(cè)，單樣本檢測(cè)可在半小時(shí)內(nèi)完成，大幅縮短了篩選周期。
4，適配高通量篩選，提升研究效率
可搭配自動(dòng)化樣本處理系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)多克隆、多條件的批量篩選，一次性完成數(shù)十個(gè)樣本的分析，極大提升了膜蛋白研究中條件優(yōu)化的效率。
四、FSEC 技術(shù)在膜蛋白研究中的核心應(yīng)用場(chǎng)景
憑借其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)SEC 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于膜蛋白研究的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成為膜蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能研究與藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的核心篩選工具。
應(yīng)用一：重組表達(dá)體系的高效優(yōu)化與篩選
膜蛋白的異源表達(dá)是其研究的第一步，而表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、標(biāo)簽的位置、克隆的選擇，都會(huì)直接影響膜蛋白的表達(dá)量、折疊狀態(tài)與穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的篩選方法需要對(duì)每一個(gè)克隆進(jìn)行蛋白純化與鑒定，工作量極大、周期極長(zhǎng)。
而 FSEC 技術(shù)可直接對(duì)不同克隆、不同載體構(gòu)建的細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)就能同步對(duì)比不同構(gòu)建體的蛋白表達(dá)量、單分散性與折疊狀態(tài)，快速篩選出最優(yōu)的表達(dá)載體與克隆，大幅縮短了表達(dá)體系優(yōu)化的周期。
圖 2 原核表達(dá)膜蛋白的 FSEC 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程
應(yīng)用二：膜蛋白純化關(guān)鍵去垢劑的快速篩選
膜蛋白的疏水性特點(diǎn)，決定了其在體外環(huán)境中必須依賴(lài)去垢劑來(lái)維持水溶性與正確的折疊狀態(tài)，因此去垢劑的選擇，是決定膜蛋白純化成敗的核心關(guān)鍵。
傳統(tǒng)的去垢劑篩選方法，需要先對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，再將蛋白分別置換至含不同去垢劑的緩沖液中，再逐一鑒定其穩(wěn)定性與單分散性，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)耗力，且會(huì)消耗大量的蛋白樣本，成為膜蛋白純化中的主要技術(shù)障礙。而 FSEC 技術(shù)可直接使用去垢劑增溶后的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需完成完整的蛋白純化流程，就能快速評(píng)估目標(biāo)膜蛋白在不同去垢劑中的單分散性、折疊狀態(tài)與穩(wěn)定性，高效篩選出最適配的去垢劑類(lèi)型與濃度，大幅降低了去垢劑篩選的時(shí)間與樣本成本。
圖 3 去垢劑溶解膜蛋白的原理示意圖
應(yīng)用三：基于 FSEC 的蛋白熱穩(wěn)定性評(píng)估（FSEC-TS）
蛋白的熱穩(wěn)定性是評(píng)估其折疊狀態(tài)、緩沖液適配性、配體結(jié)合能力的核心指標(biāo)，也是膜蛋白結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析的重要參考依據(jù)。
基于 FSEC 的熱穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)（FSEC-Thermostability，簡(jiǎn)稱(chēng) FSEC-TS），是將納克級(jí)別的純化或未純化目的蛋白，在設(shè)定的溫度梯度下進(jìn)行孵育，再通過(guò) SEC 色譜柱分離與熒光檢測(cè)器采集信號(hào)，通過(guò)洗脫峰的變化分析蛋白的變性情況，最終獲得蛋白的變性（熔解）溫度。通過(guò) FSEC-TS 技術(shù)，可快速篩選出能提升目的蛋白穩(wěn)定性的緩沖液體系、添加劑、配體等條件，為膜蛋白的純化、儲(chǔ)存與結(jié)構(gòu)解析提供關(guān)鍵的參考數(shù)據(jù)。
綜上，F(xiàn)SEC 技術(shù)憑借其高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、可高通量篩選的核心優(yōu)勢(shì)，已成為膜蛋白研究中同源物篩選、表達(dá)載體優(yōu)化、去垢劑篩選、熱穩(wěn)定性評(píng)估等環(huán)節(jié)的強(qiáng)大工具，助力科研人員突破膜蛋白研究的技術(shù)瓶頸，目前已有大量膜蛋白（包括 LeuT、ApcT、ASIC、P2X、GluA2、GluCl 等）的結(jié)構(gòu)解析，均依賴(lài) FSEC 技術(shù)完成了前期的關(guān)鍵篩選工作。
作為生命科學(xué)領(lǐng)域一站式解決方案服務(wù)商，優(yōu)寧維可為廣大科研工作者提供 FSEC 實(shí)驗(yàn)所需的高分辨率 Superdex/Superose 系列分子篩預(yù)裝柱、層析系統(tǒng)配套設(shè)備、熒光標(biāo)簽表達(dá)載體、各類(lèi)膜蛋白研究專(zhuān)用去垢劑等全系列產(chǎn)品與技術(shù)支持，助力您的膜蛋白研究工作順利推進(jìn)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，除 FSEC 外，熒光偏振光譜、差示掃描熒光法等多種新型膜蛋白篩選技術(shù)也逐步被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究、藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了更多高效的技術(shù)方案。
常見(jiàn)問(wèn)題 FAQ
1，F(xiàn)SEC 技術(shù)只能用于膜蛋白的研究嗎？
不是的。FSEC 技術(shù)的核心是通過(guò) GFP 融合標(biāo)簽的熒光信號(hào)追蹤目的蛋白的狀態(tài)，除了膜蛋白之外，該技術(shù)同樣適用于水溶性蛋白的表達(dá)水平、單分散性、穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性的檢測(cè)與篩選，尤其適合水溶性蛋白早期表達(dá)體系與純化條件的快速優(yōu)化。
2，做 FSEC 實(shí)驗(yàn)必須融合 GFP 標(biāo)簽嗎？
常規(guī)的 FSEC 實(shí)驗(yàn)以 GFP 標(biāo)簽為核心檢測(cè)標(biāo)記，也是目前應(yīng)用最廣泛的方案，其優(yōu)勢(shì)在于 GFP 的熒光信號(hào)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)，且商業(yè)化的熒光檢測(cè)器均有成熟的檢測(cè)方法。除此之外，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，使用 mCherry 等其他熒光蛋白標(biāo)簽，只需匹配對(duì)應(yīng)激發(fā) / 發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器即可完成檢測(cè)。
3，F(xiàn)SEC 與普通 SEC-HPLC 的核心區(qū)別是什么？
普通 SEC-HPLC 主要通過(guò)紫外吸收（通常 280nm）進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)來(lái)自于蛋白的色氨酸、酪氨酸等殘基，無(wú)法區(qū)分目的蛋白與雜蛋白，因此必須使用純化后的蛋白樣本進(jìn)行檢測(cè)；而 FSEC 通過(guò)特異性的熒光信號(hào)檢測(cè)目的蛋白，不受雜蛋白干擾，粗裂解液即可直接上樣，同時(shí)檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于普通紫外檢測(cè)，更適合早期的大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn)。
4，膜蛋白 FSEC 實(shí)驗(yàn)中，去垢劑的選擇有什么基礎(chǔ)原則？
首先，去垢劑需在實(shí)驗(yàn)濃度下無(wú)明顯的熒光背景干擾，避免影響檢測(cè)結(jié)果；其次，需根據(jù)目標(biāo)膜蛋白的特性，選擇臨界膠束濃度（CMC）合適的去垢劑，保證其能充分溶解膜蛋白，同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致蛋白變性失活；另外，SEC 色譜柱的分離緩沖液中，需保持與樣本處理中一致的去垢劑類(lèi)型與濃度，避免蛋白在色譜分離過(guò)程中發(fā)生聚集。
5，F(xiàn)SEC-TS 技術(shù)相比其他蛋白熱穩(wěn)定性檢測(cè)方法有什么優(yōu)勢(shì)？
相比差示掃描量熱法（DSC）、差示掃描熒光法（DSF）等技術(shù)，F(xiàn)SEC-TS 的核心優(yōu)勢(shì)在于：檢測(cè)信號(hào)僅來(lái)自于目的蛋白，不受樣本中雜蛋白、添加劑的干擾，即使是未純化的粗裂解液也能完成檢測(cè)；同時(shí)可直接通過(guò)洗脫峰的變化，區(qū)分蛋白的熱聚集、降解等不同的變性行為，獲得更全面的蛋白穩(wěn)定性信息；且所需的蛋白樣本量極低，納克級(jí)別的蛋白即可完成一次完整的溫度梯度檢測(cè)。
但長(zhǎng)期以來(lái)，膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)與功能研究始終面臨諸多技術(shù)瓶頸：膜蛋白普遍存在天然表達(dá)水平低、強(qiáng)疏水性的特點(diǎn)，且在體外純化過(guò)程中極易發(fā)生聚集、失活，難以長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的折疊狀態(tài)，這些問(wèn)題極大限制了膜蛋白研究的推進(jìn)。而熒光檢測(cè)尺寸排阻色譜（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng) FSEC）技術(shù)的出現(xiàn)，為膜蛋白研究中的各類(lèi)篩選難題提供了高效、快速的解決方案，成為當(dāng)下膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中不可或缺的核心工具。
一、FSEC 技術(shù)的核心原理
FSEC 技術(shù)是將尺寸排阻色譜（SEC）的分子篩分離能力，與高特異性的熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的分析方法。
其核心設(shè)計(jì)是將目標(biāo)研究蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行共價(jià)融合表達(dá)，通過(guò)熒光檢測(cè)器對(duì) GFP 的特異性信號(hào)進(jìn)行捕獲，無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)純化操作，就能直接、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)粗裂解液或純化過(guò)程中目的蛋白的表達(dá)水平、分布狀態(tài)與折疊情況。
在 FSEC 的層析圖譜中，我們可以通過(guò)三個(gè)核心維度讀取樣本信息：洗脫峰的峰面積直接反映目的蛋白的表達(dá)水平；洗脫峰的出峰位置與洗脫體積，可對(duì)應(yīng)計(jì)算出融合蛋白的近似分子量；而峰形與峰的分布，則直觀(guān)體現(xiàn)了目的蛋白的單分散性與折疊狀態(tài)。通常情況下，折疊正確、狀態(tài)均一、單分散性好的蛋白，會(huì)呈現(xiàn)出對(duì)稱(chēng)的高斯型洗脫峰；而發(fā)生聚集、多分散、未正確折疊或狀態(tài)不穩(wěn)定的蛋白，則會(huì)出現(xiàn)多個(gè)不對(duì)稱(chēng)的洗脫峰，或在排阻體積位置出現(xiàn)高聚集峰。
二、FSEC 技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程
FSEC 實(shí)驗(yàn)的操作流程簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的樣本前處理，核心流程如下：
1，重組表達(dá)載體構(gòu)建：將目的基因克隆至帶有 GFP 標(biāo)簽的表達(dá)載體中，可根據(jù)需求選擇原核或真核表達(dá)體系；
2，蛋白表達(dá)：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中，進(jìn)行目的融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
3，樣本制備：收集表達(dá)后的細(xì)胞，通過(guò)裂解、去垢劑增溶處理后，經(jīng)超高速離心去除不溶性雜質(zhì)，收集的上清液即可作為 FSEC 的上樣樣本；
4，色譜檢測(cè)：將制備好的樣本直接上樣至經(jīng)對(duì)應(yīng)緩沖液預(yù)平衡的 SEC 分子篩色譜柱，通過(guò)串聯(lián)的熒光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器，同步采集信號(hào)并獲得層析圖譜，完成分析。
圖 1 FSEC 技術(shù)整體實(shí)驗(yàn)流程與檢測(cè)原理示意圖
三、FSEC 技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)
相比傳統(tǒng)的蛋白分析與篩選方法，F(xiàn)SEC 技術(shù)在膜蛋白研究中具備不可替代的優(yōu)勢(shì)，完美適配膜蛋白早期篩選的核心需求：
1，超高檢測(cè)特異性，無(wú)雜蛋白干擾
FSEC 的檢測(cè)信號(hào)僅來(lái)自于與目的蛋白融合的 GFP 標(biāo)簽，細(xì)胞內(nèi)源性的雜蛋白無(wú)對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)，因此即使是未純化的全細(xì)胞裂解液，也能精準(zhǔn)捕獲目的蛋白的信號(hào)，完全不受背景雜蛋白的干擾。
2，超高靈敏度，低樣本量即可檢測(cè)
該技術(shù)的熒光檢測(cè)靈敏度可達(dá) ng 級(jí)別，僅需幾毫升的細(xì)胞培養(yǎng)物，就能完成一次完整的檢測(cè)分析，大幅降低了樣本制備的成本與工作量，尤其適合珍貴樣本或難表達(dá)蛋白的早期篩選。
3，樣本前處理簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短
無(wú)需進(jìn)行蛋白純化、標(biāo)簽切除、樣本濃縮等繁瑣操作，細(xì)胞經(jīng)裂解、去垢劑增溶和離心除雜后，即可直接上樣檢測(cè)，單樣本檢測(cè)可在半小時(shí)內(nèi)完成，大幅縮短了篩選周期。
4，適配高通量篩選，提升研究效率
可搭配自動(dòng)化樣本處理系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)多克隆、多條件的批量篩選，一次性完成數(shù)十個(gè)樣本的分析，極大提升了膜蛋白研究中條件優(yōu)化的效率。
四、FSEC 技術(shù)在膜蛋白研究中的核心應(yīng)用場(chǎng)景
憑借其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)SEC 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于膜蛋白研究的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成為膜蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能研究與藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的核心篩選工具。
應(yīng)用一：重組表達(dá)體系的高效優(yōu)化與篩選
膜蛋白的異源表達(dá)是其研究的第一步，而表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、標(biāo)簽的位置、克隆的選擇，都會(huì)直接影響膜蛋白的表達(dá)量、折疊狀態(tài)與穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的篩選方法需要對(duì)每一個(gè)克隆進(jìn)行蛋白純化與鑒定，工作量極大、周期極長(zhǎng)。
而 FSEC 技術(shù)可直接對(duì)不同克隆、不同載體構(gòu)建的細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)就能同步對(duì)比不同構(gòu)建體的蛋白表達(dá)量、單分散性與折疊狀態(tài)，快速篩選出最優(yōu)的表達(dá)載體與克隆，大幅縮短了表達(dá)體系優(yōu)化的周期。
圖 2 原核表達(dá)膜蛋白的 FSEC 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程
應(yīng)用二：膜蛋白純化關(guān)鍵去垢劑的快速篩選
膜蛋白的疏水性特點(diǎn)，決定了其在體外環(huán)境中必須依賴(lài)去垢劑來(lái)維持水溶性與正確的折疊狀態(tài)，因此去垢劑的選擇，是決定膜蛋白純化成敗的核心關(guān)鍵。
傳統(tǒng)的去垢劑篩選方法，需要先對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，再將蛋白分別置換至含不同去垢劑的緩沖液中，再逐一鑒定其穩(wěn)定性與單分散性，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)耗力，且會(huì)消耗大量的蛋白樣本，成為膜蛋白純化中的主要技術(shù)障礙。而 FSEC 技術(shù)可直接使用去垢劑增溶后的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需完成完整的蛋白純化流程，就能快速評(píng)估目標(biāo)膜蛋白在不同去垢劑中的單分散性、折疊狀態(tài)與穩(wěn)定性，高效篩選出最適配的去垢劑類(lèi)型與濃度，大幅降低了去垢劑篩選的時(shí)間與樣本成本。
圖 3 去垢劑溶解膜蛋白的原理示意圖
應(yīng)用三：基于 FSEC 的蛋白熱穩(wěn)定性評(píng)估（FSEC-TS）
蛋白的熱穩(wěn)定性是評(píng)估其折疊狀態(tài)、緩沖液適配性、配體結(jié)合能力的核心指標(biāo)，也是膜蛋白結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析的重要參考依據(jù)。
基于 FSEC 的熱穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)（FSEC-Thermostability，簡(jiǎn)稱(chēng) FSEC-TS），是將納克級(jí)別的純化或未純化目的蛋白，在設(shè)定的溫度梯度下進(jìn)行孵育，再通過(guò) SEC 色譜柱分離與熒光檢測(cè)器采集信號(hào)，通過(guò)洗脫峰的變化分析蛋白的變性情況，最終獲得蛋白的變性（熔解）溫度。通過(guò) FSEC-TS 技術(shù)，可快速篩選出能提升目的蛋白穩(wěn)定性的緩沖液體系、添加劑、配體等條件，為膜蛋白的純化、儲(chǔ)存與結(jié)構(gòu)解析提供關(guān)鍵的參考數(shù)據(jù)。
綜上，F(xiàn)SEC 技術(shù)憑借其高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、可高通量篩選的核心優(yōu)勢(shì)，已成為膜蛋白研究中同源物篩選、表達(dá)載體優(yōu)化、去垢劑篩選、熱穩(wěn)定性評(píng)估等環(huán)節(jié)的強(qiáng)大工具，助力科研人員突破膜蛋白研究的技術(shù)瓶頸，目前已有大量膜蛋白（包括 LeuT、ApcT、ASIC、P2X、GluA2、GluCl 等）的結(jié)構(gòu)解析，均依賴(lài) FSEC 技術(shù)完成了前期的關(guān)鍵篩選工作。
作為生命科學(xué)領(lǐng)域一站式解決方案服務(wù)商，優(yōu)寧維可為廣大科研工作者提供 FSEC 實(shí)驗(yàn)所需的高分辨率 Superdex/Superose 系列分子篩預(yù)裝柱、層析系統(tǒng)配套設(shè)備、熒光標(biāo)簽表達(dá)載體、各類(lèi)膜蛋白研究專(zhuān)用去垢劑等全系列產(chǎn)品與技術(shù)支持，助力您的膜蛋白研究工作順利推進(jìn)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，除 FSEC 外，熒光偏振光譜、差示掃描熒光法等多種新型膜蛋白篩選技術(shù)也逐步被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究、藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了更多高效的技術(shù)方案。
常見(jiàn)問(wèn)題 FAQ
1，F(xiàn)SEC 技術(shù)只能用于膜蛋白的研究嗎？
不是的。FSEC 技術(shù)的核心是通過(guò) GFP 融合標(biāo)簽的熒光信號(hào)追蹤目的蛋白的狀態(tài)，除了膜蛋白之外，該技術(shù)同樣適用于水溶性蛋白的表達(dá)水平、單分散性、穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性的檢測(cè)與篩選，尤其適合水溶性蛋白早期表達(dá)體系與純化條件的快速優(yōu)化。
2，做 FSEC 實(shí)驗(yàn)必須融合 GFP 標(biāo)簽嗎？
常規(guī)的 FSEC 實(shí)驗(yàn)以 GFP 標(biāo)簽為核心檢測(cè)標(biāo)記，也是目前應(yīng)用最廣泛的方案，其優(yōu)勢(shì)在于 GFP 的熒光信號(hào)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)，且商業(yè)化的熒光檢測(cè)器均有成熟的檢測(cè)方法。除此之外，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，使用 mCherry 等其他熒光蛋白標(biāo)簽，只需匹配對(duì)應(yīng)激發(fā) / 發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器即可完成檢測(cè)。
3，F(xiàn)SEC 與普通 SEC-HPLC 的核心區(qū)別是什么？
普通 SEC-HPLC 主要通過(guò)紫外吸收（通常 280nm）進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)來(lái)自于蛋白的色氨酸、酪氨酸等殘基，無(wú)法區(qū)分目的蛋白與雜蛋白，因此必須使用純化后的蛋白樣本進(jìn)行檢測(cè)；而 FSEC 通過(guò)特異性的熒光信號(hào)檢測(cè)目的蛋白，不受雜蛋白干擾，粗裂解液即可直接上樣，同時(shí)檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于普通紫外檢測(cè)，更適合早期的大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn)。
4，膜蛋白 FSEC 實(shí)驗(yàn)中，去垢劑的選擇有什么基礎(chǔ)原則？
首先，去垢劑需在實(shí)驗(yàn)濃度下無(wú)明顯的熒光背景干擾，避免影響檢測(cè)結(jié)果；其次，需根據(jù)目標(biāo)膜蛋白的特性，選擇臨界膠束濃度（CMC）合適的去垢劑，保證其能充分溶解膜蛋白，同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致蛋白變性失活；另外，SEC 色譜柱的分離緩沖液中，需保持與樣本處理中一致的去垢劑類(lèi)型與濃度，避免蛋白在色譜分離過(guò)程中發(fā)生聚集。
5，F(xiàn)SEC-TS 技術(shù)相比其他蛋白熱穩(wěn)定性檢測(cè)方法有什么優(yōu)勢(shì)？
相比差示掃描量熱法（DSC）、差示掃描熒光法（DSF）等技術(shù)，F(xiàn)SEC-TS 的核心優(yōu)勢(shì)在于：檢測(cè)信號(hào)僅來(lái)自于目的蛋白，不受樣本中雜蛋白、添加劑的干擾，即使是未純化的粗裂解液也能完成檢測(cè)；同時(shí)可直接通過(guò)洗脫峰的變化，區(qū)分蛋白的熱聚集、降解等不同的變性行為，獲得更全面的蛋白穩(wěn)定性信息；且所需的蛋白樣本量極低，納克級(jí)別的蛋白即可完成一次完整的溫度梯度檢測(cè)。
| 名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
| Series S Sensor Chip CM5 | BR100530 | EA |
| Series S Sensor chip CM7 | 28953828 | EA |
| Amine Coupling Kit | BR100050 | EA |
| Series S Sensor Chip SA | BR100531 | EA |
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