活細胞表面賴氨酸足跡法捕捉病毒誘導的構象動力學并揭示甲流宿主因子
方法創(chuàng)新
LiFT技術的核心在于使用細胞表面特異性化學探針OPA-S-S-alkyne。該探針可特異性結合活細胞外膜蛋白的賴氨酸殘基。當配體與細胞表面受體發(fā)生相互作用時，受體構象發(fā)生改變，導致其表面賴氨酸殘基的可及性產生差異。通過LC-MS/MS分析，比較標記肽段的質譜峰面積，可精準捕獲這種賴氨酸可及性的動態(tài)變化，進而實現(xiàn)互作界面定位與構象動態(tài)解析。該探針包括富集基團和可切割基團，能夠有效地從復雜的生物樣品中分離低豐度的膜蛋白，從而提高了對罕見或弱相互作用的表面蛋白構象變化的檢測靈敏度。
LiFT技術的系統(tǒng)性驗證
為驗證LiFT的有效性，研究者在兩種經典模型系統(tǒng)中進行了測試。首先在人血清白蛋白(HSA)-布洛芬的體系中，LiFT通過質譜分析精準捕捉到了布洛芬結合口袋周圍賴氨酸可及性的特異性改變，其結果與已知晶體結構高度吻合，證明了LiFT在檢測配體誘導構象變化方面具有高靈敏度與空間分辨率。
進一步在活細胞體系中，作者應用LiFT研究表皮生長因子(EGF)與其受體EGFR的相互作用。成功監(jiān)測到EGF刺激后EGFR胞外域多個賴氨酸殘基的可及性發(fā)生改變。全局分析顯示，除了EGFR本身，還有49個細胞表面蛋白的賴氨酸標記也發(fā)生顯著變化。功能富集分析表明，這些蛋白顯著富集于與EGFR相關的通路。此外，蛋白互作網絡分析顯示EGFR在互作網絡的核心地位，且超過一半的響應蛋白在公共數(shù)據(jù)庫中已被記錄為EGFR的相互作用因子。這些結果表明LiFT能夠特異性識別細胞表面的配體-受體相互作用以及相關構象變化。
圖1.通過賴氨酸可及性分析，LiFT能夠靈敏地檢測到配體誘導的HSA構象變化
圖2.LiFT捕捉到EGF誘導的活細胞表面的構象變化
IAV宿主因子的篩選與驗證
基于上述驗證，研究者將LiFT應用于甲型流感病毒（IAV）與宿主細胞之間的相互作用，完成了病毒在A549細胞表面附著過程誘導的構象變化圖譜。質譜數(shù)據(jù)顯示，IAV結合引發(fā)了廣泛的賴氨酸可及性變化，涉及大量細胞表面蛋白。功能分析表明這些蛋白富集于“病毒受體活性”和“共生體侵入宿主細胞”等條目，提示其高度參與病毒感染過程。
鑒于唾液酸在IAV感染中的作用已得到證實，通過整合構象數(shù)據(jù)和定量唾液酸譜，證明了許多表現(xiàn)出病毒誘導的可及性變化的蛋白質是高度唾液酸化的，支持唾液酸在調節(jié)IAV附著中的作用。
圖3.LiFT能夠在系統(tǒng)范圍內分析IAV附著時細胞表面的構象變化
除了已知的IAV附著因子外，LiFT還新識別一種參與病毒進入的宿主因子—胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)。CRISPR/Cas9敲除IGF1R顯著降低了IAV的感染效率，而重新表達該蛋白則能完全恢復病毒易感性，證明了表型的特異性。在天然對IAV感染具有抵抗性的Lec1細胞（一種糖基化缺陷型CHO細胞）中異源表達IGF1R，能夠顯著提升該細胞對病毒的易感性，證明IGF1R促進細胞對IAV的感染。
在機制上，研究通過分子對接與免疫共沉淀，證實了IGF1R胞外域與病毒血凝素(HA)的直接互作。此類膜蛋白-病毒蛋白的瞬時結合因技術所限此前少有報道，凸顯了LiFT的技術優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R缺陷細胞呈現(xiàn)α-2,6-唾液酸化水平下降與病毒附著受損的關聯(lián)表型；同時，可溶性IGF1R胞外域可競爭性抑制HA與細胞的結合，為其作為功能性受體提供了直接證據(jù)。
最后，靶向干預實驗顯示，IGF1R特異性中和抗體及多種小分子抑制劑，均能在體外有效且選擇性地抑制IAV感染。這些遺傳、生化與藥理學數(shù)據(jù)共同確立了IGF1R是介導IAV早期感染的關鍵宿主因子，并初步驗證了其作為抗病毒靶點的潛力。
圖4.IGF1R作為IAV附著因子的功能驗證
圖5.IGF1R作為IAV的結合與入侵因子發(fā)揮作用
總結
總結而言，LiFT技術作為一種新型化學蛋白質組學工具，實現(xiàn)了活細胞表面配體-受體相互作用及構象動態(tài)的分析，彌補了傳統(tǒng)方法在生理環(huán)境互作檢測中的不足。此外，LiFT技術具有廣泛的適用性，可拓展至小分子藥物-蛋白互作、病毒-宿主互作、免疫細胞識別等多個研究領域，為生物機制解析與治療靶點發(fā)現(xiàn)提供強大技術支撐，有望推動相關領域的研究進展。
文獻鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c14196
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