建議收藏：搞定流式抗體滴定的四大關(guān)鍵步驟

流式實驗中需要使用的新的流式抗體或者對于抗體使用濃度不太清楚時，就需要進行滴度。流式抗體滴定是流式實驗成功、獲得可重復(fù)且準確數(shù)據(jù)的基石，其主要原理是通過不斷稀釋抗體，找到既能有效結(jié)合目標抗原，又能避免非特異性染色的最佳濃度。合理的滴度實驗可以有效的提升信噪比、節(jié)約成本同時優(yōu)化實驗條件，保證不同實驗條件（如細胞類型、實驗方案、溫度等）下最佳抗體使用濃度，獲得最佳使用效果。

一、滴定前準備

確定滴定范圍：

參考抗體說明書或文獻推薦的起始濃度。若無，可從 0.125 µg/test 到 2-4 µg/test 開始（對于直接標記抗體），通常設(shè)置4-6個梯度。

準備樣本：

• 使用與正式實驗相同的樣本類型（如：同種屬的脾細胞、PBMC、細胞系等）。

• 樣本應(yīng)包含明確的陽性群體和陰性群體（用于計算信噪比）。如果目標抗原表達未知，可用已知陽性和陰性的細胞系或通過刺激/未刺激樣本對比。

• 準備足夠的細胞，每個濃度點至少需要 5×10^5 - 1×10^6 個細胞（考慮設(shè)置復(fù)孔和對照）。

必要對照：

• 未染色對照：只加細胞，不加抗體。

• 同型對照：與滴定抗體相同物種、亞型、標記物的非特異性抗體，用于設(shè)置電壓和評估背景。注意：現(xiàn)代流式更推薦使用熒光減一對照（FMO） 來設(shè)門，尤其是在多色實驗中。
   

二、滴度實驗

示例：滴定小鼠抗人CD3-FITC抗體，建議測試濃度：0.125， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 µg/test。

1. 分配細胞：取5支流式管，每管加入1×10^6個細胞（體積一致，如100µL）。

2. 稀釋抗體：將抗體母液按計劃梯度稀釋至工作液濃度，確保每管加入的體積一致（例如10µL），并用緩沖液（如含1% BSA的PBS）補足體積至相同。

3. 孵育：按照標準染色流程（避光、4°C或冰上孵育15-30分鐘）。

4. 洗滌與重懸：加入2-3mL染色緩沖液，離心棄上清，用300-500µL緩沖液或固定液重懸細胞，上機檢測。

5. 設(shè)置儀器：先用未染色對照調(diào)節(jié)所有通道的電壓，使陰性群體落在對數(shù)坐標軸的10^0-10^1范圍內(nèi)。此后，所有樣本的電壓保持不變！

三、數(shù)據(jù)分析與最適濃度選擇

1. 獲取數(shù)據(jù)：記錄每個濃度下陽性群體和陰性群體的平均熒光強度（MFI）。

2. 計算關(guān)鍵指標（任選其一，推薦染色指數(shù)SI）：

• 信噪比（S/N） = 陽性MFI / 陰性MFI

• 染色指數(shù)（SI） = （陽性MFI - 陰性MFI） / （2 × 陰性群體的標準差）

  SI更客觀，因為它考慮了陰性群體的分布寬度。SI值最大時對應(yīng)的濃度通常是最優(yōu)濃度。

3. 繪制曲線：以抗體濃度為X軸（對數(shù)坐標），SI或S/N為Y軸，繪制曲線。

曲線會先快速上升（抗體不足區(qū)），然后進入一個平臺期（最適飽和區(qū)），最后可能緩慢下降（抗體過量導致背景增高）。

4. 選擇最適濃度：

• 理想選擇：選擇平臺期起始點或平臺期中段的濃度。例如，如果0.5 µg/test時SI已達平臺期最大值，那么1.0 µg/test并未帶來更好分離，就應(yīng)選擇0.5 µg/test作為工作濃度。

• 實踐選擇：在平臺期范圍內(nèi)，有時會選擇比理論最優(yōu)濃度稍高一點的濃度，以應(yīng)對樣本間的小幅差異，確保穩(wěn)定性。

四、注意事項

1. 對于CD3、CD4、CD8這類分群明顯且間隔非常開的指標，只做細胞性質(zhì)確定設(shè)門用的時候，可不進行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指標。

2. 樣本狀態(tài)：確保細胞活性高（>90%），死細胞會增加非特異性染色�？紤]使用活死染料。

3. 關(guān)于全陽的細胞的滴定，可以在樣本染色后加入未染色的細胞；對于表達量比較少的稀有細胞群體，在染色時，可加入該群細胞的父級細胞群的抗體。

4. 緩沖液：使用含蛋白（如BSA）的染色緩沖液阻斷非特異性結(jié)合。

5. Fc受體阻斷：對于表達Fc受體的細胞（如巨噬細胞、B細胞等），務(wù)必在染色前進行Fc受體阻斷。

6. 記錄與重復(fù)：詳細記錄所有使用的濃度、批號和實驗條件。新批次抗體必須重新滴定，即使貨號相同。

7. 固定：如果需要固定細胞，滴定實驗應(yīng)在固定后進行，因為固定可能影響熒光強度。

8. 實際實驗過程中在一定的細胞密度范圍內(nèi)，抗體的染色指數(shù)只與抗體的濃度有關(guān)，與細胞密度無關(guān)。比如染色體系不變，細胞增加10倍，可以不用增加抗體濃度。

 

   

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