抗體純化的前期處理、實驗流程及注意事項全解析

抗體純化全解析
抗體，又稱免疫球蛋白，是由人體免疫系統(tǒng)中的B淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后增殖分化形成的漿細(xì)胞所分泌的一種蛋白質(zhì)�？贵w的結(jié)構(gòu)如同一個“Y”字形，由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過二硫鍵連接而成。想要得到高純度的抗體用于后期的應(yīng)用，進(jìn)行抗體純化是必不可少的重要技能，接下來，小優(yōu)就帶你一起看看抗體純化的重要知識點吧。

一、抗體的基本性質(zhì)
在純化抗體之前，需要我們對抗體的基本性質(zhì)進(jìn)行收集和了解，以指導(dǎo)我們制定更合理的純化方案。對于蛋白純化來說，我們在純化之前需要了解目標(biāo)蛋白的分子量，等電點，疏水性和穩(wěn)定性等性質(zhì)。

1、分子量
IgG抗體的分子量為150-170KD：重鏈為50-75KD，輕鏈為25KD。IgM的分子量為900KD；使用分子篩去除聚集體時可以選擇Superdex 200 Increase（貨號：28990944），這款分子篩的分離范圍 10-600 KD，適合抗體純化。

2、等電點
抗體的等電點從PH4.0-9.0不等，大部分超過PH6.0；
使用離子交換層析，可以使用陽離子捕獲或者陰離子流穿模式，去除大部分 DNA、HCP 和內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

3、疏水性
大多數(shù) IgG 疏水性強(qiáng)，單抗在硫酸銨 30-50% 時會沉淀，可重溶后直接上疏水層析�？梢钥紤]使用0.5-1.0 M 硫酸銨結(jié)合疏水介質(zhì)。

4、PH穩(wěn)定性
在一般緩沖液中較穩(wěn)定，應(yīng)避免長時間處于較酸性的環(huán)境；使用ProteinA或者ProteinG酸性洗脫時，需要在收集管中加入中和試劑，以防止抗體變性；

5、聚集體
沒有保護(hù)劑的情況下 IgG 濃度高于 2mg/ml 易形成多聚體；
在pH<3的情況下，抗體會發(fā)生不可逆聚集；鹽濃度過高增強(qiáng)抗體的疏水聚集；

二、前期處理
在上層析柱純化之前，樣品處理的步驟必不可少。細(xì)胞上清和血清中雜質(zhì)較少，可以通過離心和過濾的步驟后使用層析柱進(jìn)行純化；
如果抗體來源是動物腹水，樣品中會含有大量的脂蛋白和血清蛋白，需要進(jìn)行特殊的處理，可以參考以下的方法：

1、方法一：在二價離子存在的情況下，硫酸右旋葡萄糖酐能夠沉淀脂蛋白，沉淀可以通過離心除去。步驟如下：
（1）每毫升樣品中加入 0.04ml 10% 的硫酸右旋葡萄糖酐和 1ml 1M 的 CaCl₂；
（2）混合 15 分鐘；10000 xg離心 10 分鐘；丟棄沉淀；
（3）使用脫鹽柱將樣品置換到適合純化的緩沖液中；

2、方法二：PVP 能產(chǎn)生一個 pH 依賴的沉淀效應(yīng)，PVP 在 pH=7.0 時能夠沉淀 β- 脂蛋白和球蛋白，但是脂蛋白不能在低于 pH4.0 時沉淀。步驟如下：
（1）加入固體 PVP 到樣品溶液中，至最終濃度為 3%（w/v）；
（2）在 4 度攪拌 4 小時；17000 xg離心；丟棄沉淀；
（3）使用脫鹽柱將樣品置換到適合純化的緩沖液中；

3、方法三：使用飽和硫酸銨處理。步驟如下：
（1）4℃ 以 10000 ×g 離心樣品；
（2）加入 1 份 1M Tris-HCl（pH8.0）到 10 份樣品中以維持 pH；
（3）輕柔攪拌，加入飽和硫酸銨溶液，逐滴添加至飽和度達(dá)到50%；攪拌一個小時；
（4）10000 ×g 離心 20 分鐘；離心后丟棄形成上層的脂蛋白。使用等體積等密度的硫酸銨溶液清洗沉淀兩次；
（5）使用脫鹽柱將樣品置換到適合純化的緩沖液中；

三、抗體純化
抗體純化可以按照親和層析—離子交換/疏水層析—凝膠過濾層析三步方法進(jìn)行。由于ProteinA/G蛋白具有較為特異性的吸附抗體的性質(zhì)，所以第一步通常是使用ProteinA/G層析柱或者填料進(jìn)行親和層析；第二步可以選擇離子交換或者疏水層析去除一些核酸，宿主蛋白和內(nèi)毒素等雜質(zhì)；最后一步使用凝膠過濾層析精純，進(jìn)一步去除痕量雜質(zhì)和抗體聚集體。由于ProteinA/G填料的高特異性，一般一步親和層析就可以達(dá)到90%的純度，后續(xù)如果需要去除宿主核酸，HCP，內(nèi)毒素，聚集體等雜質(zhì)，可以進(jìn)行進(jìn)一步純化；

1、ProteinA和ProteinG填料怎么選擇？
和ProteinA填料相比，Protein G Sepharose 可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合更多類型的 IgG，多克隆 IgG 及人 IgG，同時血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配基脫落也相對更低。具體可以參考下面的圖片，加號越多表示結(jié)合能力越強(qiáng)；

Protein A 的載量（50 mg 人 IgG/mL Protein A Fast Flow，貨號17127901）相比于 Protein G（18 mg 人 IgG/mL Protein G Fast Flow，貨號17061801）更高。

和ProteinG填料相比，ProteinA填料洗脫pH更加溫和，更適合于保持抗體的穩(wěn)定性。

需要特別注意的是，針對小鼠的 IgG1，Protein A 結(jié)合相對弱。此時可以考慮兩種純化方案：（1）使用ProteinG填料進(jìn)行純化，但由于 Protein G 結(jié)合力較強(qiáng)，因此有時需要 pH 低于 2.0 才能有效洗脫，容易導(dǎo)致對酸敏感的抗體聚集沉淀；（2）或者也可以考慮使用結(jié)合力相對較弱的 Protein A 填料進(jìn)行純化，結(jié)合緩沖液中需要加入 0.5-3M 的氯化鈉以增加結(jié)合能力，目標(biāo)抗體在 pH4.5 左右就可以被溫和的洗脫。

2、ProteinA,ProteinG的純化緩沖液是什么？
ProteinA填料：
結(jié)合緩沖液：20 mM sodium phosphate, pH 7.0
洗脫緩沖液：0.1 M sodium citrate,pH 3-6
在收集管中預(yù)先加入60-200ul 1M Tris-HCl pH 9.0 /ml收集液；

ProteinG填料：
結(jié)合緩沖液：20mM sodium phosphate, pH 7.0
洗脫緩沖液：0.1 M glycine-HCl,pH 2.7
在收集管中預(yù)先加入60-200ul 1M Tris-HCl pH 9.0 /ml收集液；

注意：因為抗體純化采用酸性溶液洗脫，為了防止抗體變性，需要預(yù)先在收集管中加入中和溶液Tris-HCl。

3、ProteinA,G填料如何清洗？
常規(guī)的ProteinA,G填料不耐堿，建議反向清洗：
（1）對于沉淀或變性的蛋白：用 6M 鹽酸胍清洗 2 個柱體積，立即用 5 個柱體積的 pH 7-8 結(jié)合緩沖液來清洗，反向沖洗，每次清洗時間不超過 10min。
（2）對于去除疏水性的物質(zhì)（如疏水性蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)）：使用非離子型去污劑，如 0.1% Triton X-100，37 度孵育 1min。立即用至少 5 個柱體積的結(jié)合緩沖液清洗；或者 70% 乙醇浸泡 12 小時左右，然后立即用 5 個柱體積的 pH 7-8 結(jié)合緩沖液來清洗。注意 70% 乙醇處理時，需要降低流速。

鹽酸胍的清洗效果有限，如果想要徹底清洗填料，可以選擇耐堿的ProteinA填料。MabSelect SuRe填料（貨號：17543801）可以耐受0.5M NaOH清洗；MabSelect PrismA填料（貨號：17549801）可以耐受1M NaOH清洗，持續(xù)保持高性能。

4、洗脫液嘗試降低pH，抗體發(fā)生沉淀？
可以嘗試在洗脫液中加入0.5-1M精氨酸，使用0.5M arginine-HCl體系洗脫。精氨酸有利于穩(wěn)定蛋白，提高回收率和防止抗體聚集；

或者也可以考慮換成Protein A填料，可以在更高的pH條件下洗脫；

5、ProteinA,G填料如何保存？
為了抑制微生物生長，抗體親和層析填料的儲存液一般是20%乙醇或2%苯甲醇，儲存溫度：2-8 ℃。儲存液在長期保存過程中需要定期更換。

6、抗體片段如何進(jìn)行純化？
Cytiva針對抗體的不同片段都有特異性的產(chǎn)品，可以根據(jù)下圖進(jìn)行選擇：