冷凍電鏡技術是什么？原理、應用與發(fā)展深度解讀

冷凍電子顯微鏡（Cryo-electron microscopy，簡稱Cryo-EM）是指對冷凍樣品進行電子顯微鏡觀察的技術。其目的是盡可能觀察樣品接近天然狀態(tài)下的結構。該技術特別適用于含水樣品，因此已成為研究生物樣本的重要工具。

一、發(fā)展背景與挑戰(zhàn)

冷凍電子顯微鏡的誕生經歷半世紀之久。20世紀30年代，在Ernst Ruska研制出第一臺電子顯微鏡后不久，Ladislaus Marton意識到，使用這種儀器研究生物樣品時，“有機細胞會因強烈的電子轟擊而遭到破壞”。他提出，需要開發(fā)新的樣品制備技術，例如對樣品進行冷卻。20世紀50年代，Humberto Fernández-Morán首次進行了低溫電子顯微鏡實驗，但樣品在冷凍過程中因形成冰晶而受到損傷。20世紀70年代中期，Taylor和Glaeser發(fā)現(xiàn)，冷卻樣品可提高其對輻射損傷的耐受性。然而，直到20世紀80年代，Jacques Dubochet找到了一種不產生冰晶的樣品冷凍方法，現(xiàn)代低溫電子顯微鏡才真正誕生。
冷凍電鏡技術主要面臨三個挑戰(zhàn)。

1. 在樣品制備、轉移至顯微鏡以及在顯微鏡中觀察過程中，需要保持樣品處于低于-140°C的低溫狀態(tài)。
2. 電子束敏感性。即使在冷凍條件下，樣品也極易受到電子束輻射的損傷，因此透射電鏡（TEM）通常采用低劑量條件成像，掃描電鏡（SEM）則采用低電壓成像。
3. 在冷凍透射電鏡中，信號來源于電子束與樣品的直接相互作用，卻沒有使用重金屬染色來增強對比度，由于信噪比（SNR）較差，導致成像質量不高。

二、實驗流程


冷凍電鏡首先通過超低溫冷凍技術固定生物大分子或材料，利用透射電子顯微鏡（TEM）觀測其三維結構。其核心原理可概括為以下三步：
1、低溫固定：將含水樣品（如蛋白質溶液、細胞組織）快速浸入-196℃的液氮冷卻乙烷中，數(shù)毫秒內實現(xiàn)“玻璃化凍結”——避免傳統(tǒng)冷凍導致的冰晶損傷，，而是轉化為無定形的玻璃態(tài)冰，完美鎖定樣品的天然構象。
2、電子成像：在液氦溫度（4.3K）或液氮溫度（77K）下，電子束穿透樣品形成二維投影圖像。由于生物分子結構復雜，需從數(shù)百至上百萬張不同角度的投影圖中提取信息。
3、三維重構：利用計算機算法對數(shù)千張不同角度的二維圖像進行分類、對齊與平均處理，通過迭代重投法、自適應建模等技術，反向推算出樣品的三維結構模型。如今，該技術已能實現(xiàn) 1.8Å的近原子分辨率（1Å=0.1 納米），清晰呈現(xiàn)蛋白質的氨基酸側鏈、核酸的堿基配對等細節(jié)。

三、冷凍電鏡分析技術

近年來，“冷凍電鏡”這一術語僅被用于指代冷凍透射電子顯微鏡的結構生物學研究。然而，冷凍電鏡實際上還包括兩種被廣泛使用的技術——單顆粒分析（SPA）與冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）。
那么需要關注的是，我需要采用單顆粒分析還是冷凍電子斷層掃描呢？

單顆粒分析（SPA）技術針對純化后的生物大分子（如蛋白質、病毒、核酸復合物），利用其在溶液中隨機取向的特性，采集數(shù)十萬甚至數(shù)百萬張單顆粒二維投影圖像，通過計算機算法進行分類、對齊與三維重構，最終獲得高分辨率三維結構。該技術無需樣品結晶，僅需微量純化樣品即可實現(xiàn)解析，尤其適用于異質性強、難結晶的大分子復合物。 優(yōu)勢：

• 解析生物大分子的分辨率最高可達原子級（~1-3Å）。
• 樣品受總輻射值小。
• 對稱顆粒的解析分辨率更高，是獲取其精細結構的黃金標準。
• 適合分子量大的樣品。分子量越大，結果越好。

冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）類比醫(yī)院電腦斷層掃描斷層掃描技術，通過旋轉樣品臺（傾斜角度范圍-60°至+60°），對冷凍后的細胞、組織或原位樣品進行多角度二維成像，獲取40-60張不同角度的投影圖，再基于“中心截面定理”進行三維重構，形成樣品的三維斷層圖像。結合子斷層圖像平均法（STA），分辨率最高可達3Å，實現(xiàn)細胞內原位生物大分子的結構觀測。該技術通常應用于細胞層面的研究，用于分析細胞器的結構及其相互之間的關系，并可應用于完整的小型樣品（如細菌）的觀察。對于較大較厚的樣品，則需要進行切片減薄處理。該技術的重要性在于，它能夠在細胞內天然環(huán)境中揭示分子結構的真實形態(tài)。
優(yōu)勢：

• 保存原始空間背景，直接展示目標分子在細胞原生環(huán)境(原位)中的真實狀態(tài)、位置和與其他細胞器的空間關系。
• 作為一種"無假設"的觀測方法，可以在復雜的細胞環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的結構或已知分子的未知組裝形式。
• 簡單直接，對樣品的要求較低。

四、Cryo-EM在結構生物學的應用

1.新冠病毒刺突蛋白的動態(tài)構象
清華大學李賽團隊與浙江大學李蘭娟團隊合作解析出新冠病毒全病毒三維結構（見圖2），對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育、分子動力學模擬等具有十分重要作用，為疫苗設計提供了關鍵依據(jù)。
2.噬藻體A4的侵染機制
中國科學技術大學周叢照團隊解析了侵染模式藍藻魚腥藻PCC 7120的肌尾噬藻體A-1（L）尾部機器的完整三維結構，揭示了噬藻體A-1（L）與其特異性宿主藍藻相互作用的結構基礎和分子機制。有助于深入理解噬藻體與宿主藍藻相互作用的分子機制，為將來開發(fā)環(huán)境友好型底盤噬藻體奠定理論基礎。
3.阿爾茨海默病 tau 蛋白的聚集體結構
英國利茲大學的研究團隊掃描了阿爾茨海默病患者的死后腦組織，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者大腦中的β-淀粉樣蛋白中存在混合的微觀絲狀結構，稱為纖維絲，以及其他結構。為揭示阿爾茨海默病的發(fā)展機制提供了方向。并且還能啟示科學家用于分析其他神經退行性疾病的根本原因。



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