吸入型mRNA-LNP粒徑分布、表面電荷及包封效率霧化穩(wěn)定性表征

霧化吸入為mRNA-LNP提供了一種非侵入性、靶向肺部的高效遞送策略。然而，霧化過程中產(chǎn)生的剪切力、界面張力及壓力變化可能影響LNP的完整性與穩(wěn)定性，進(jìn)而改變其遞送效率和安全性。本文結(jié)合北京元森凱德生物公司研制的霧化給藥設(shè)備MicroSprayer Aerosolizer（型號：HY-LWH03，BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD）具體實驗研究，系統(tǒng)介紹了吸入霧化過程中脂質(zhì)納米顆粒（LNP）粒徑分布、表面電荷及mRNA包封率的表征方法，闡明其穩(wěn)定性機(jī)制，為吸入型核酸納米制劑的開發(fā)與質(zhì)控提供技術(shù)參考。
（一）主要關(guān)鍵的儀器設(shè)備 1. 霧化給藥設(shè)備
MicroSprayer Aerosolizer（型號：HY-LWH03，BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD）用于大/小鼠氣管內(nèi)霧化給藥，產(chǎn)生可吸入氣溶膠，控制粒徑在 1–5 µm 區(qū)間。
 

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2. 粒徑/電位/包封率表征
動態(tài)光散射儀（DLS）:測量 LNP 的粒徑、PDI 和 ζ 電位。
 
微量紫外-可見分光光度計 / RiboGreen 熒光法:測定 mRNA 包封率（游離 vs 包載 mRNA）。
 

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3. 體內(nèi)成像與定量
小動物活體成像系統(tǒng):實時捕捉 Luciferase 或 tdTomato 熒光信號，評估器官分布與表達(dá)強(qiáng)度。
Living Image® 軟件:用于 ROI 圈選與熒光強(qiáng)度定量（p/s/cm²/sr）。
 

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4. 分子與蛋白檢測
Western blot 系統(tǒng)：檢測 FAH、dulaglutide、β-actin 等蛋白表達(dá)。
 
ELISA 讀板機(jī)：測定血清中 dulaglutide 蛋白濃度。
 
qPCR 儀：用于 mRNA 合成后的純度與完整性驗證（補(bǔ)充方法常規(guī)步驟）。
 
 

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5. 組織學(xué)與共聚焦成像
激光掃描共聚焦顯微鏡：觀察肝切片 tdTomato、FAH 免疫熒光共定位。
 
正置熒光顯微鏡：采集 Sirius red 膠原染色圖像，評估肝纖維化面積。
 
石蠟切片機(jī) + 自動染色平臺：制備 H&E、Sirius red 切片。
 
 

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6. 血清生化分析
全自動生化分析儀：測定 ALT、AST、TBIL、UREA、CREA 等肝腎功能指標(biāo)。
 
 

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7. 輔助設(shè)備
超低溫冰箱（–80 °C）、冷凍離心機(jī)（≥15 000 g）、超聲水浴、脂質(zhì)體擠出器：用于 LNP 制備、分裝與儲存。
 
（二）實驗步驟
脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是目前mRNA遞送的主流載體，其理化性質(zhì)包括粒徑、表面電荷和包封率，直接影響其在體內(nèi)的分布、細(xì)胞攝取和表達(dá)效率。在吸入給藥過程中，LNP需經(jīng)歷霧化、氣溶膠化、沉積等多個動態(tài)階段，這些過程可能破壞脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致mRNA泄漏或顆粒聚集。因此，建立系統(tǒng)可靠的表征方法，明確霧化對LNP關(guān)鍵性質(zhì)的影響，是確保吸入制劑有效性與安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
一、粒徑分布與多分散指數(shù)（PDI）的表征
方法原理
采用動態(tài)光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）技術(shù)，通過檢測顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動所引起的散射光波動，推算粒徑大小與分布。多分散指數(shù)（PDI）用于評估體系的均一性，PDI<0.2通常表示體系分布較窄。
 
實驗操作與數(shù)據(jù)分析
霧化前后分別取適量LNP樣品，用緩沖液適當(dāng)稀釋后，注入比色皿，置于DLS儀中進(jìn)行檢測。
 
記錄流體力學(xué)直徑（Z-average size）與PDI值。若霧化后粒徑變化在±5 nm以內(nèi)，PDI仍低于0.2，可認(rèn)為LNP在霧化中未發(fā)生顯著聚集或破碎。
在研究中，無論是中性LNP（ALC-0315）還是帶電LNP（含DOTAP/DOPG），粒徑均保持在100–200 nm，PDI<0.2，表明霧化過程未破壞其結(jié)構(gòu)完整性。
二、表面電荷（ζ電位）的測定
測定原理
ζ電位反映顆粒表面在溶液中的電性特征，影響其與生物膜的相互作用及體內(nèi)穩(wěn)定性。通常通過電泳光散射法測定。
 
關(guān)鍵步驟與結(jié)果解讀
將LNP樣品置于特定電泳池，在電場作用下顆粒發(fā)生遷移，儀器通過激光多普勒測速計算ζ電位。
霧化后，中性LNP的ζ電位應(yīng)保持在−5至+5 mV范圍內(nèi)；帶電LNP變化幅度應(yīng)小于±2 mV。若結(jié)果符合，說明霧化過程中未引起脂質(zhì)重組或表面電荷屏蔽。
例如，研究中DOTAP-LNP霧化后電位仍維持在正電位區(qū)間，DOPG-LNP保持負(fù)電位，表明表面電荷穩(wěn)定。
 
三、mRNA包封率的準(zhǔn)確評估
常用方法：RiboGreen熒光法
RiboGreen是一種高靈敏度熒光染料，可特異性地結(jié)合RNA。通過比較裂解前后LNP中mRNA的熒光信號，計算包封率。
 
操作流程
將樣品分為兩組：一組用Triton X-100等表面活性劑完全裂解，測得總mRNA含量；另一組不裂解，離心后取上清測游離mRNA。
包封率（%）=（總mRNA − 游離mRNA）/ 總mRNA × 100%。
研究顯示霧化后包封率仍高于85%，部分達(dá)90%以上，說明霧化未引起mRNA明顯泄漏。
 
輔助驗證
微量紫外-可見分光光度法也可用于快速檢測核酸濃度與純度，但靈敏度不及熒光法，常作為RiboGreen法的補(bǔ)充。
四、綜合分析與穩(wěn)定性機(jī)制探討

結(jié)構(gòu)耐受性：粒徑與PDI穩(wěn)定反映LNP未融合或碎裂；ζ電位恒定說明表面化學(xué)組成未變；高包封率確認(rèn)mRNA仍受保護(hù)。
 
穩(wěn)定機(jī)制：優(yōu)化配方中的PEG化脂質(zhì)（如DMG-PEG2000）可在顆粒表面形成空間穩(wěn)定層；溫和的霧化設(shè)備（如YSKD Bio-Tech MicroSprayer）減少機(jī)械應(yīng)力；合理脂質(zhì)組成（如DSPC與膽固醇）維持雙層剛性，抵抗界面擾動。
 
五、展望
通過系統(tǒng)評估霧化前后LNP的粒徑分布、表面電荷及mRNA包封率，可科學(xué)判斷其吸入穩(wěn)定性與工藝適應(yīng)性。本研究基于DLS、ζ電位分析與RiboGreen熒光法等關(guān)鍵技術(shù)，證實了經(jīng)優(yōu)化的mRNA-LNP在霧化后仍保持結(jié)構(gòu)完整與功能穩(wěn)定，為吸入型核酸制劑的開發(fā)、質(zhì)控及臨床轉(zhuǎn)化提供了可靠的表征策略與實驗依據(jù)。未來可進(jìn)一步結(jié)合透射電鏡、體外氣溶膠性能分析等多維度手段，完善吸入納米制劑的綜合評價體系。
參考文獻(xiàn)：
①Nebulized Lipid Nanoparticles Deliver mRNA to the Liver for Treatment of Metabolic Diseases，pubs.acs.org/NanoLett (2025)
 
②Inhalable biomimetic polyunsaturated fatty acid-based nanoreactors for peroxynitrite augmented ferroptosis potentiate radiotherapy in lung cancer，Journal of Nanobiotechnology (2025)
 
附：北京元森凱德生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的動物霧化吸入給藥儀器，主要包括大/小動物肺部氣管直接遞送裝置（動物氣道霧化針）、小動物霧化給藥儀，動物口鼻吸入、僅鼻腔霧化/鼻腦給藥器、全身式暴露染毒、動物煙氣/PM2.5染毒系統(tǒng)、粉塵氣溶膠發(fā)生器、液體氣溶膠發(fā)生器、靜式吸入染毒柜、臭氧動物暴露裝置、動物高低壓氧艙，此外給客戶多樣化提供自動型實驗動物安樂處死系統(tǒng)（窒息系統(tǒng)、二氧化碳安樂處死箱），實驗動物除臭暫存系統(tǒng)，巴馬香豬皮，NGI Gentle Rocker智能洗盤裝置，NGI新一代撞擊器和ACI安德森撞擊器的校驗與檢測。
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