Pipetty 電動移液器在牛羊副流感病毒中和試驗中的應用

方案摘要：本方案在牛羊副流感病毒（牛副流感病毒3型BPIV3、羊副流感病毒3型CPIV3）中和試驗中使用Pipetty電動移液器，并結合該儀器精準度高、操作穩(wěn)定、適配性強的核心優(yōu)勢，規(guī)范實驗準備、樣品處理、血清稀釋、病毒孵育及細胞接種等關鍵環(huán)節(jié)，確保實驗結果的可靠性與重復性，為牛羊副流感病毒感染的血清學檢測提供標準化技術支撐。
 
方案詳情：

• 實驗原理

通過待檢血清中的中和抗體與牛羊副流感病毒（BPIV3/CPIV3）特異性結合，抑制病毒對敏感MDBK細胞的感染和致病變作用（CPE）。利用Pipetty電動移液器精準控制血清稀釋比例、病毒液及細胞懸液加樣量，通過觀察細胞病變情況，采用Reed-Muench法計算血清中和抗體效價，從而判定待檢血清中是否存在特異性中和抗體及效價水平，為臨床疫病診斷和免疫效果評估提供依據。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸頭；
② 臺式離心機；
③ CO₂恒溫培養(yǎng)箱；
③ 生物安全柜；
④ 倒置顯微鏡；
⑤ 細胞計數(shù)儀；
⑥ 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)。
 
2、試劑和材料
① 96孔細胞培養(yǎng)板；
② 96孔U型板；
③ MDBK細胞；
④ MEM培養(yǎng)基；
⑤ FBS、馬血清；
⑥ 0.5%胰酶消化液；
⑦ 陽性血清、陰性血清、待檢血清(血清經56℃水浴滅活30min)；
⑧ 病毒液(50pL含50TCID50~300TCID50的病毒)。
三、實驗步驟
1、將血液樣品以2000r/min離心5min~10min，在生物安全柜內，使用Pipetty電動移液器配合無菌吸頭，精準吸取上層血清至無菌離心管中，避免吸入血細胞，待檢。
2、將MDBK傳代細胞用0.5%胰酶消化液消化后，用細胞培養(yǎng)液分散細胞，通過細胞計數(shù)儀計數(shù)后，將細胞稀釋至1×10⁶個/mL~2×10⁶個/mL。使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液模式，以每孔100μL的量精準分裝至96孔細胞培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，形成90%~95%融合單層細胞，備用。
 
3、在生物安全柜內，取96孔U型板，使用Pipetty電動移液器，使用混勻模式，用MEM培養(yǎng)基將待檢血清在96孔U型板上從1:4開始進行倍比稀釋，連續(xù)稀釋8個稀釋度，最終稀釋至1:512，每孔保留稀釋后的血清50μL。每份血清設置4個重復孔，確保實驗重復性。
4、設立陽性血清對照、陰性血清對照、正常細胞對照和接毒細胞對照，每個對照設置2個重復孔。檢測牛、羊血清時陽性和陰性對照樣品分為:
a)檢測牛血清樣品，使用BPIV3陽性牛血清、陰性牛血清和BPIV3作為對照;
b)檢測羊血清樣品，使用CPIV3陽性山羊或綿羊血清、陰性山羊或綿羊血清和CPIV3作為對照。
5、使用連續(xù)分液功能向96孔U型板中每孔精準加入50μL病毒液，將U型板置于37℃恒溫環(huán)境中孵育1h。
 
6、孵育結束后，在生物安全柜內，使用Pipetty電動移液器將樣品精準接種至已制備好的MDBK單層細胞的96孔細胞培養(yǎng)板對應孔中，接種過程中避免移液器槍頭觸碰細胞層，防止損傷單層細胞。接種完成后，將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，期間每日通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。
7、培養(yǎng)72h后，取出培養(yǎng)板，通過倒置顯微鏡觀察并記錄每份血清各稀釋度孔的細胞病變（CPE）情況，判斷標準為：無CPE記為中和陽性，出現(xiàn)CPE記為中和陰性。采用Reed-Muench法計算血清的中和抗體效價，即能抑制50%細胞出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋倍數(shù)。
 
四、結果判定
1、正常細胞對照孔和陽性血清對照孔細胞生長正常，無CPE出現(xiàn)；陰性血清對照孔和病毒對照孔細胞出現(xiàn)明顯CPE，方可判定試驗成立，結果有效。若對照孔不符合上述條件，需重新進行實驗。
2、被檢血清中和抗體效價≥1:4，判定為陽性，提示被檢牛羊曾感染或接種過對應副流感病毒，體內產生特異性中和抗體；被檢血清中和抗體效價<1:4，判定為陰性，提示被檢牛羊未產生有效中和抗體（需結合臨床情況排除感染初期等特殊情況）。