DC-PGKI通過(guò)激活NRF2通路抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制研究

一、靶向PGK1抑制糖酵解-激酶雙功能調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及其在結(jié)腸炎治療中的潛力
糖酵解代謝酶通過(guò)感知代謝狀態(tài)變化，在免疫代謝領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）作為糖酵解途徑中的關(guān)鍵催化酶，其功能調(diào)控受到廣泛關(guān)注。本研究首先構(gòu)建了高通量篩選平臺(tái)，成功鑒定出一種新型PGK1抑制劑DC-PGKI。該抑制劑以ATP競(jìng)爭(zhēng)性方式結(jié)合PGK1，解離常數(shù)（Kd）為99.08 nmol/L，表現(xiàn)出高親和力。研究證實(shí)，DC-PGKI在體外及體內(nèi)均能穩(wěn)定PGK1蛋白水平，并有效抑制其糖酵解活性與激酶功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DC-PGKI可顯著影響脂多糖（LPS）刺激下巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答，具體表現(xiàn)為抑制白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的產(chǎn)生。機(jī)制研究表明，抑制PGK1可導(dǎo)致核因子E2相關(guān)因子2（NRF2，由NFE2L2基因編碼）在細(xì)胞內(nèi)積累，并促進(jìn)其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。進(jìn)入細(xì)胞核的NRF2能夠結(jié)合于*Il-1b*與*Il-6*基因的鄰近調(diào)控區(qū)域，從而抑制LPS誘導(dǎo)的上述基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在疾病模型中，應(yīng)用DC-PGKI干預(yù)能有效緩解葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀。上述結(jié)果不僅證實(shí)了PGK1在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，也揭示了靶向PGK1開(kāi)發(fā)抑制劑為炎癥性腸病等炎癥性疾病提供潛在治療策略的科學(xué)依據(jù)。

二、基于反向偶聯(lián)反應(yīng)的PGK1高通量篩選平臺(tái)建立與抑制劑鑒定
為篩選靶向PGK1的小分子抑制劑，本研究建立了一種基于酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢測(cè)平臺(tái)。該平臺(tái)利用PGK1與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）共同催化的可逆反應(yīng)特性，通過(guò)監(jiān)測(cè)NADH在340 nm處的吸光度變化，間接反映PGK1的催化活性。具體而言，在含有3-磷酸甘油酸（3-PG）、ATP、NADH及過(guò)量GAPDH的反應(yīng)體系中，加入PGK1可啟動(dòng)逆反應(yīng)生成1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG），后者立即被GAPDH還原并伴隨NADH消耗，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PGK1酶動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（圖1A）。

首先，對(duì)從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化的重組PGK1進(jìn)行酶學(xué)表征，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)（1,3-BPG的Km = 189.4 ± 4.8 μmol/L，ATP的Km = 1.30 ± 0.11 mmol/L，Kcat = 956 ± 41.7 s⁻¹）與已報(bào)道的人源PGK1數(shù)據(jù)一致。經(jīng)條件優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系中PGK1與GAPDH的最佳濃度分別為0.40 nmol/L與0.10 μmol/L，以保證GAPDH始終處于過(guò)量狀態(tài)。該檢測(cè)體系在驗(yàn)證中顯示出良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，其Z因子為0.54，符合高通量篩選要求（圖1B）。

利用該平臺(tái)對(duì)內(nèi)部化合物庫(kù)進(jìn)行初步篩選，在單劑量50 μmol/L條件下選取抑制率高于50%的化合物進(jìn)行劑量-反應(yīng)分析，并進(jìn)一步通過(guò)GAPDH單獨(dú)催化實(shí)驗(yàn)排除非特異性干擾分子。最終鑒定出包括dorsomorphin、purvalanol A、MK-571及LTP-10在內(nèi)的多個(gè)PGK1抑制劑，其IC50值介于1.96至25.24 μmol/L之間（圖1C–D）。其中，purvalanol A的抑制活性（IC50 = 1.96 μmol/L）與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證實(shí)了本篩選體系的可靠性。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，選取具有新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的LTP-10進(jìn)行深入分析。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，LTP-10對(duì)底物3-PG表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而對(duì)ATP則呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式，其Ki值為2.59 ± 0.01 μmol/L（圖1E–F）。此外，熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，LTP-10可顯著提高PGK1的熱變性溫度，提示其可能通過(guò)結(jié)合并穩(wěn)定PGK1蛋白構(gòu)象發(fā)揮抑制作用。以上結(jié)果驗(yàn)證了該篩選平臺(tái)在發(fā)現(xiàn)與表征PGK1抑制劑方面的有效性與應(yīng)用價(jià)值。

三、DC-PGKI通過(guò)靶向PGK1抑制巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β與IL-6的表達(dá)
代謝重編程在免疫細(xì)胞炎癥應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其與有氧糖酵解過(guò)程密切相關(guān)。先前研究表明，糖酵解酶PKM2可通過(guò)磷酸化STAT3等信號(hào)分子，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）與白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)，其小分子抑制劑在多種炎癥模型中顯示出治療潛力。受此啟發(fā)，本研究探討了另一關(guān)鍵糖酵解酶PGK1是否在巨噬細(xì)胞炎癥調(diào)控中具有類(lèi)似功能。

本研究利用PGK1抑制劑DC-PGKI作為化學(xué)探針，在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7細(xì)胞及原代骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）中評(píng)估其對(duì)炎性因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，DC-PGKI以濃度依賴(lài)性方式顯著抑制LPS誘導(dǎo)的*Il-1b*與*Il-6*的mRNA表達(dá)（圖4A–B），并降低其蛋白水平（圖4C），而對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)無(wú)顯著影響。與已知糖酵解抑制劑2-DG及PKM2特異性抑制劑TEPP-46/DASA-58相比，DC-PGKI對(duì)IL-1β與IL-6均具有抑制作用，提示其作用機(jī)制可能不僅限于干擾糖酵解代謝途徑。為進(jìn)一步驗(yàn)證DC-PGKI的作用依賴(lài)于PGK1，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲低巨噬細(xì)胞中PGK1的表達(dá)。結(jié)果顯示，PGK1敲低可模擬DC-PGKI的效應(yīng)，顯著抑制IL-1β與IL-6的產(chǎn)生（圖4E–G），且不影響TNF-α表達(dá)。此外，在PGK1敲低細(xì)胞中回補(bǔ)表達(dá)siRNA抗性的PGK1蛋白，可恢復(fù)IL-1β與IL-6的表達(dá)水平（圖4H），表明DC-PGKI對(duì)炎性因子的抑制作用是經(jīng)由PGK1介導(dǎo)的。綜上，本研究證實(shí)PGK1在巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答中具有重要調(diào)控功能，其抑制劑DC-PGKI可通過(guò)靶向PGK1選擇性抑制IL-1β與IL-6的表達(dá)，為炎癥性疾病的靶向治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

四、DC-PGKI通過(guò)KEAP1-NRF2通路抑制IL-1β與IL-6表達(dá)
既往研究提示，抑制PGK1可能影響KEAP1的翻譯后修飾，從而促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）的積累及其下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。類(lèi)似地，內(nèi)源性代謝物衣康酸可通過(guò)修飾KEAP1激活NRF2并發(fā)揮抗炎作用�；�于此，本研究進(jìn)一步探討DC-PGKI是否通過(guò)調(diào)控NRF2通路介導(dǎo)其抗炎效應(yīng)。

結(jié)果表明，DC-PGKI處理可呈時(shí)間與濃度依賴(lài)性地下調(diào)KEAP1蛋白水平，并相應(yīng)增加NRF2蛋白表達(dá)及其經(jīng)典下游靶基因血紅素加氧酶1（HMOX1）的mRNA與蛋白水平（圖5A–C）。在脂多糖（LPS）刺激與否的條件下，DC-PGKI均能顯著上調(diào)包括Txnrd1、Prdx1、Gclc、Sod1等在內(nèi)的多個(gè)NRF2調(diào)控基因的表達(dá)（圖5E–H）。此外，在293T細(xì)胞中進(jìn)行的NRF2依賴(lài)性熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)DC-PGKI可激活NRF2轉(zhuǎn)錄活性（圖5D）。在KEAP1突變或缺失的細(xì)胞系中，DC-PGKI未引起NRF2積累，表明其作用具有KEAP1依賴(lài)性。為明確NRF2在DC-PGKI抑制炎性因子表達(dá)中的作用機(jī)制，本研究通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DC-PGKI處理后，NRF2在Il-1b、Il-6及經(jīng)典靶基因Nqo1啟動(dòng)子鄰近區(qū)域的結(jié)合顯著增強(qiáng)（圖6I–K），而對(duì)照基因血栓烷合酶（Txs）內(nèi)含子區(qū)未見(jiàn)明顯變化。綜上所述，DC-PGKI可通過(guò)降低KEAP1蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)NRF2核轉(zhuǎn)位及其與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制IL-1β與IL-6的表達(dá)。該結(jié)果揭示了PGK1抑制劑調(diào)控炎癥反應(yīng)的一條新機(jī)制，即通過(guò)激活KEAP1-NRF2抗氧化通路實(shí)現(xiàn)抗炎作用。

五、總結(jié)
本研究圍繞糖酵解關(guān)鍵酶PGK1在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用展開(kāi)系統(tǒng)性探索。首先，成功構(gòu)建了基于反向酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量篩選平臺(tái)，并鑒定出新型ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑DC-PGKI。該抑制劑不僅有效抑制PGK1的糖酵解與激酶雙功能，更通過(guò)靶向PGK1選擇性抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)，而對(duì)TNF-α無(wú)顯著影響。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，DC-PGKI通過(guò)促進(jìn)KEAP1降解，激活NRF2信號(hào)通路，增強(qiáng)NRF2核轉(zhuǎn)位及其與*Il-1b*、*Il-6*基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平抑制炎癥因子表達(dá)。最終，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，DC-PGKI展現(xiàn)出明確的治療潛力。本研究成果不僅揭示了PGK1在免疫代謝調(diào)控中的新功能，也為其作為炎癥性疾病（如炎癥性腸病）的治療靶點(diǎn)提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

六、IL-1 β/L-1F2細(xì)胞因子檢測(cè)哪里有？
IL-1β（又名IL-1F2）是固有免疫與炎癥反應(yīng)的核心介質(zhì)，在感染、損傷及腫瘤微環(huán)境中起關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)作用。其信號(hào)通過(guò)調(diào)控炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫細(xì)胞分化及細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)，深度重塑腫瘤免疫應(yīng)答格局。