G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的分類、藥物的作用方式及在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）是最大的細(xì)胞表面膜受體超家族，由約1000個基因編碼，具有保守的七次跨膜（7TM）螺旋結(jié)構(gòu)。GPCR廣泛存在于人體各個組織和器官中。它們在細(xì)胞與外界環(huán)境之間傳遞信號，調(diào)控細(xì)胞的許多基本功能，包括感知光線、味道、氣味以及調(diào)節(jié)心跳、血壓、免疫反應(yīng)等生理過程。簡單來說，GPCR就像細(xì)胞的“接收器”，它們感知體內(nèi)外的各種信號（比如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等），并將這些信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)。由于其在生理和病理過程中的重要性，GPCR成為了現(xiàn)代藥物研發(fā)的一個重要靶點。

一、GPCR的作用與分類
1．感官受體： 如視網(wǎng)膜中的光感受器、鼻腔中的嗅覺受體等。
2．代謝受體： 調(diào)控體內(nèi)能量代謝、糖尿病、肥胖等的藥物靶點。
3．神經(jīng)遞質(zhì)受體： 對神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺、去甲腎上腺素等的信號傳導(dǎo)起作用，許多神經(jīng)精神疾病（如抑郁癥、精神分裂癥）的治療靶點。
4．免疫系統(tǒng)受體： 在免疫反應(yīng)和炎癥中發(fā)揮重要作用，許多免疫疾病（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）與此相關(guān)。
5. 激素受體： 包括腎上腺素受體、腎上腺皮質(zhì)激素受體等，參與調(diào)節(jié)心血管、內(nèi)分泌等功能。

二、GPCR與藥物
由于GPCR在多種生理和病理過程中扮演著至關(guān)重要的角色，因此它們是藥物研發(fā)的核心靶點之一。當(dāng)前大約30%–40%的藥物直接作用于GPCR，涵蓋了抗高血壓、抗過敏、抗精神病等多種藥物。大多數(shù)GPCR藥物為小分子（約92%），而非抗體等生物模式。GPCR的藥物研究需要關(guān)注其激動劑或拮抗劑的篩選、信號通路的激活與抑制、受體與配體的結(jié)合親和力等方面。

藥物作用方式：
激動劑： 這類藥物通過與GPCR結(jié)合，激活受體，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。比如β-受體激動劑用于治療哮喘。

拮抗劑： 拮抗劑與GPCR結(jié)合，但不激活它，而是阻止其激活，從而中斷某些生理反應(yīng)。例如，抗高血壓藥物常通過拮抗某些GPCR來降低血壓。

偏向性激動劑/拮抗劑： 這類藥物能夠選擇性地激活或抑制受體某些特定的功能。這是現(xiàn)代GPCR藥物研究的熱點之一，因為它能夠減少副作用，提高藥物的療效。

三、GPCR與藥物研發(fā)
隨著GPCR靶向藥物的不斷研發(fā)，如何高效、精準(zhǔn)地檢測GPCR的活性、受體信號傳遞以及藥物的作用效果，已成為推動藥物研發(fā)的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。GPCRs歷來是高通量篩選（HTS）最常篩選的目標(biāo)。

HTS是一種用于快速識別藥物靶點的方法，可以對數(shù)十萬種化合物進行靶標(biāo)篩選。成功的HTS需要大量基礎(chǔ)設(shè)施，包括結(jié)構(gòu)多樣的小分子庫，以及信息學(xué)和生物學(xué)等多個科學(xué)學(xué)科的整合。HTS檢測必須經(jīng)過充分驗證，以確保其高度可重復(fù)、穩(wěn)健、低成本且兼容檢測自動化。

GPCR HTS最常用的方法包括研究受體激活下游的細(xì)胞內(nèi)活動。例如，這些方法測量第二信使，如Ca2+、cAMP（環(huán)腺苷單磷酸）、IP1（肌醇單磷酸）和pERK（磷酸細(xì)胞外信號調(diào)控激酶）、基因表達報告細(xì)胞，以及β-抑制素的招募到GPCR。

1.第二信使：cAMP（環(huán)磷酸腺苷）/ Ca²⁺/ IP1（肌醇單磷酸）
現(xiàn)在已有許多兼容HTS的檢測技術(shù)可以測量這些GPCR第二信使。TR-FRET（均相時間分辨熒光）能夠持續(xù)產(chǎn)生高質(zhì)量數(shù)據(jù)，采用均質(zhì)檢測，信號和試劑穩(wěn)定性優(yōu)異，兼容測驗自動化，且兼容384和1536孔板。

以 cAMP 為例
THUNDER™ cAMP檢測是用于定量測定細(xì)胞裂解液中的3′，5′-環(huán)單磷酸腺苷（cAMP），基于均相TR-FRET技術(shù)，兼容各種物種的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，具有簡單，快速和靈敏的優(yōu)勢。試劑盒基于競爭法，標(biāo)記熒光供體和受體的cAMP抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，已經(jīng)與帶有Biotin標(biāo)簽的cAMP結(jié)合，形成復(fù)合物，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，細(xì)胞裂解液中的游離cAMP會與Biotin-cAMP競爭，與抗體FR-Ab2結(jié)合，阻斷信號產(chǎn)生，熒光信號強度與游離cAMP濃度成反比。全程僅需1h，免洗，可高通量。

圖：cAMP檢測原理，標(biāo)曲及流程

每次實驗應(yīng)包括cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線，以驗證該分析是否產(chǎn)生預(yù)期的IC50值和S/B比，并將TR-FRET信號轉(zhuǎn)換為cAMP水平。

圖：表達內(nèi)源性Gs偶聯(lián)腺苷A2a受體的U266B1細(xì)胞（2000個細(xì)胞/孔）中
激動劑濃度-反應(yīng)曲線（圖左）和拮抗劑濃度-反應(yīng)曲線（圖右）

G蛋白偶聯(lián)受體的下游信號通路多樣，具體的信號傳遞通路取決于α亞基的類型（Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13）。
● Gs / Gi → 檢測cAMP。檢測方法：THUNDER™ cAMP TR-FRET檢測
● Gq → 檢測Ca²⁺。檢測方法：鈣流檢測。Fluo-8免洗細(xì)胞鈣流檢測試劑盒 （abs50199-100T）

圖：GPCR的信號傳導(dǎo)
From: https://www.ktsmo.com/news2/info.aspx?itemid=421

2.下游磷酸化/轉(zhuǎn)錄因子
以Phospho-ERK為例
THUNDER TR-FRET時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，檢測技術(shù)靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，操作簡單，僅需1~4h。一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技術(shù)，采用夾心法，檢測胞內(nèi)ERK磷酸化水平和總ERK水平。

圖. THUNDER磷酸化蛋白檢測原理示意圖

用EGF處理HEK293細(xì)胞（50,000個細(xì)胞/孔）室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF刺激ERK1/2在T202/Y204點位的磷酸化。用抑制劑Erlotinib處理HEK293細(xì)胞（50,000個細(xì)胞/孔），在室溫下孵育15分鐘，然后用0.5nM EGF刺激細(xì)胞，在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Erlotinib可以抑制ERK1/2在T202/Y204點位的磷酸化。

圖. THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗證數(shù)據(jù)

3.基因表達報告細(xì)胞
以 雙熒光素酶報告基因檢測 為例

圖. 雙熒光素酶報告基因檢測驗證數(shù)據(jù)

HEK293細(xì)胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔，細(xì)胞密度為60%。隔日轉(zhuǎn)染 pCMVFluc 及 pCMV-Rluc 質(zhì)粒，每孔0.2µg DNA，48小時后檢測雙熒光素酶活性。圖中數(shù)值代表4孔重復(fù)平均值。A: 加了R1試劑后的熒光讀數(shù)；B：加入R1試劑讀值后，繼續(xù)加 R2 緩沖液(無底物)后的熒光讀數(shù)；C：加入R1試劑讀值后，繼續(xù)加R2 1x 工作液后的熒光讀數(shù)。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素生成氧化螢光素（Oxyluciferin），在螢光素被氧化的過程中，會產(chǎn)生光信號。海腎螢光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素氧化成腸酰胺（Coelenteramide），在腔腸素氧化的過程中也會產(chǎn)生光信號。本試劑盒的光信號可以通過化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測定儀進行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點。

4. β-Arrestin 募集和內(nèi)化（偏向性信號）
通過GPCR激活的信號通路取決于GPCR本身的一級序列和三級結(jié)構(gòu)，但最終由特定配體穩(wěn)定的特定構(gòu)象以及參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子決定。目前，GPCR被認(rèn)為主要使用兩種類型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子：G蛋白和β-arrestins 。因為β-arrestin僅對磷酸化形式的GPCR具有高親和力，所以大多數(shù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終由G蛋白激活介導(dǎo)。

5. 受體-配體互作：親和力檢測
SPR因其通量、靈敏度以及能夠表征mM至亞pM范圍內(nèi)結(jié)合分子的能力，以及標(biāo)準(zhǔn)實驗中常規(guī)提供的信息量，是藥物發(fā)現(xiàn)流程中的熱門應(yīng)用。除了親和力和靶點結(jié)合數(shù)據(jù)外，還可以評估化學(xué)計量和其他結(jié)合行為（異常動力學(xué)、非特異性結(jié)合等），如HTS篩查、微分裂熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測。

HTS篩查可采用配體競爭結(jié)合的方法，利用樣本中待測抗原與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原之間的競爭關(guān)系來進行檢測。

微分裂熒光素酶技術(shù)（Nanoluc Split Enzyme Technology）將微熒光素酶(NanoLuc)分成兩個不同的片段：大片段和小片段，兩個片段單獨不具有酶活性，而大小片段結(jié)合后恢復(fù)微熒光素酶活性。大小兩個片段可以具有高親和力或低親和力不同組合。高親和力大小片段在同一反應(yīng)體系中可以快速結(jié)合為具有酶活性的微熒光素酶，而低親和力大小片段可以借助其標(biāo)記的兩個目標(biāo)蛋白的結(jié)合而成為具有酶活性的微熒光素酶。檢測微熒光素酶大片段和小片段結(jié)合所致的微熒光素酶活性可以用于細(xì)胞蛋白的表達，調(diào)控和降解以及蛋白相互作用等領(lǐng)域的研究。

UA-Glo® Nano-luc Live Cell Assay System（UA：UA070110）微熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測試劑盒包括可以進入細(xì)胞的微熒光素酶底物和緩沖液，可以不裂解細(xì)胞檢測活細(xì)胞內(nèi)微熒光素酶大小片段結(jié)合后產(chǎn)生的微熒光素酶活性，也可以檢測微熒光素酶在活細(xì)胞中的表達。該試劑盒具有檢測靈敏度高，背景低，檢測范圍廣，檢測信號穩(wěn)定（半衰期約3hr）的優(yōu)點，特別適合化合物的高通量篩選。

圖. 微熒光素酶活細(xì)胞內(nèi)檢測驗證數(shù)據(jù)

HEK293細(xì)胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔，細(xì)胞密度為60-70%。共轉(zhuǎn)染帶分裂酶大片段及小片段標(biāo)簽的目標(biāo)分子表達質(zhì)粒，每孔 0.2µg DNA，48小時后檢測 Nanoluc 熒光素酶活性，動態(tài)讀板2小時。

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