Pipetty 電動移液器在奶粉中葉酸測定（微孔板法）的應(yīng)用

方案摘要：葉酸是鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus）生長所必需的營養(yǎng)素。在一定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后測定透光率（或吸光度值）。利用Pipetty Pro電動移液器的非等量移液功能，可高效完成樣本稀釋、標液梯度配制及接種等關(guān)鍵液體移取步驟，提升實驗操作效率與準確性。
 
 
方案詳情：
一、實驗原理
葉酸是鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus）生長所必需的營養(yǎng)素。在一定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后測定透光率（或吸光度值），在一定測定范圍內(nèi)可以根據(jù)葉酸含量與透光率（或吸光度值）的標準曲線計算出試樣中葉酸的含量。
二、實驗準備
1、試劑和材料
① 試劑；
② 培養(yǎng)基；
③ 標準品；
④ 標準溶液。
注：本方法所用試劑均為分析純，水為GB／T6682規(guī)定二級水。
 
2、儀器和設(shè)備
① Pipetty Pro電動移液器，MSIC12-01-1000；
② 天平：感量為0.1mg和1mg；
③ 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；
④ 高壓滅菌鍋；
⑤ 渦旋振蕩器；
⑥ 離心機:3000r/min；
⑦ 接種環(huán)和接種針；
⑧ PH計：精度為±0.1；
⑨ 組織粉碎機和研磨儀；
⑩ 紫外-可見分光光度計或酶標儀；
⑪ 超凈工作臺；
⑫ 超聲波振蕩器；
⑬ 13酶標儀；
⑭ 離心管；
⑮ 微孔板（無菌）；
⑯ 濾膜（0.22μ）；
⑰ 容量瓶。
注：所用玻璃器具使用前用鹽酸浸泡液或月桂基磺酸鈉洗滌劑清洗干凈后，250℃干熱1h～2h。
 
三、實驗步驟
1、稀釋：先將試樣稀釋液無菌條件下用無菌水相濾膜(0.22 μm)過濾除菌,取3支 1.5 ml無菌離心管，使用Pipetty Pro電動移液器非等量分液功能分別加入 100 μL、200 μL、300 μL試樣稀釋液,補無菌水至 500μL。每個梯度做2個平行。Pipetty PRO的程序儲存功能可保存該組稀釋參數(shù)，后續(xù)同批次實驗可直接調(diào)用，避免重復設(shè)置。
 
2、標液稀釋：借助Pipetty Pro的非等量移液功能，提前預設(shè)好標液移液參數(shù)，依次為0.00ｍＬ、0.011ｍＬ、0.022ｍＬ、0.033ｍＬ、0.044ｍＬ、0.056ｍＬ、0.067ｍＬ、0.078ｍＬ、0.089ｍＬ、1.00ｍＬ。將標準系列管依次排列后，使用Pipetty Pro移液器吸取液體，依次向各管加入預設(shè)好的葉酸標準工作溶液；隨后根據(jù)各管已加標液體積計算補水量，重新預設(shè)程序，吸取液體，向每管補水至1ｍＬ，完成后用渦旋振蕩器混勻。整個過程無需手動頻繁調(diào)整移液體積，大幅提升梯度配制效率與體積準確性。
 
3、接種和培養(yǎng)：葉酸測定培養(yǎng)基高壓滅菌冷卻后,每10 mL培養(yǎng)基中加入菌種接種液 40 μL混勻,吸取 150 μL加入微孔板中。另吸取 150 μL,標準系列管或試樣系列管加入微孔板中,所有液體添加完成后，用無菌覆膜覆蓋微孔板表面，置于渦旋振蕩器上輕柔混勻，隨后放入36℃±１℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32ｈ～40ｈ。
4、測定：將培養(yǎng)完成的微孔板取出，輕柔混勻各孔培養(yǎng)物，使用酶標儀在540ｎｍ處測定吸光度值。若0對照孔出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，提示可能存在雜菌污染，需重新進行實驗。
四、結(jié)果計算
1、以標準系列管葉酸含量為橫坐標，每個標準點透光率（或吸光度值）均值為縱坐標，繪制標準曲線。
2、從標準曲線計算試樣或酶空白系列管中葉酸的相應(yīng)含量（cx），如果３支試樣系列管中有２支葉酸 含量在0.10ｎｇ～0.80ｎｇ范圍內(nèi)，且各管之間折合為每毫升試樣提取液中葉酸含量的偏差小于10％，則 可繼續(xù)按式（1）、式（2）、式（3）進行結(jié)果計算，否則需重新取樣測定。 試樣稀釋液的葉酸濃度按式（1）計算。
 
 
 
五、其它
1、一般食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15％；營養(yǎng)素補充劑和強化食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10％。
2、添加了葉酸的樣品，稱樣量為1.0ｇ，稀釋倍數(shù)為１時，檢出限為0.5μｇ/100ｇ，定量限為1.0μｇ/100ｇ。