AKT通路的生物學(xué)功能、抑制劑研發(fā)格局及常用表型檢測(cè)指標(biāo)

2025年11月12日，來(lái)凱醫(yī)藥授予齊魯制藥在中國(guó)研究、開(kāi)發(fā)和商業(yè)化AKT抑制劑LAE002（Afuresertib）的獨(dú)家許可，來(lái)凱最高可獲得總額高達(dá)20.45億元人民幣的里程碑款項(xiàng)。LAE002是一種有效的AKT抑制劑，可同時(shí)靶向AKT1、AKT2和AKT3三種亞型，精準(zhǔn)滿足HR+/HER2-乳腺癌的臨床治療需求。目前僅有阿斯利康A(chǔ)KT抑制劑Capivasertib獲批用于HR+/HER2-乳腺癌上市銷售，LAE002極有可能成為全球該領(lǐng)域第二款上市藥物。

一、AKT 通路的生物學(xué)功能
AKT（也稱為蛋白激酶B，PKB）是PI3K–AKT–mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在細(xì)胞存活、增殖、代謝、遷移等多個(gè)方面發(fā)揮核心作用。
1.抗凋亡：AKT 可通過(guò)磷酸化 Bad、caspase-9、caspase-3 等調(diào)控細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。
2.促進(jìn)增殖：AKT可磷酸化GSK-3β，從而穩(wěn)定cyclin D1，并抑制細(xì)胞周期抑制子（如 p27、p21）表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展。
3.促進(jìn)血管生成：通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)、eNOS活性等機(jī)制，AKT通路有助促進(jìn)腫瘤血管生成。
4.通路異常與腫瘤關(guān)聯(lián)：在多種癌癥中，PI3K/AKT通路過(guò)度激活（如PI3K突變、AKT突變、PTEN缺失）是驅(qū)動(dòng)化療或靶向耐藥的重要機(jī)制，與不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖：PI3K/Akt/mTOR軸

各種生長(zhǎng)因子作用于跨膜受體并使其活化，PI3K信號(hào)通路也因此而激活。胞漿面PIP3濃度升高，作為第二信使與AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合分別使AKT Thr308和Ser473磷酸化導(dǎo)致AKT完全激活，繼而磷酸化mTOR及其下游分子p70S6K、4E-BP1，下傳生存信號(hào)。PTEN作為負(fù)調(diào)控因子，能使PIP3去磷酸將其轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2而降解，從而阻斷AKT及其下游分子的有效活化。

From：QI H, FAN L. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2010;13(12):1149-1154. doi:10.3779/j.issn.1009-3419.2010.12.13

二、AKT 抑制劑研發(fā)格局
盡管 AKT 是非常有前景的靶點(diǎn)，但目前真正進(jìn)入臨床的AKT抑制劑相對(duì)較少，但隨著首款A(yù)KT抑制劑獲批，AKT通路成為越來(lái)越多公司聚焦的核心靶點(diǎn)。

1. 阿斯利康：2023年11月， Capivasertib獲FDA批準(zhǔn)上市，與Fulvestrant(氟維司群)聯(lián)合使用，用于治療激素受體(HR)陽(yáng)性、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陰性、伴有一種或多種生物標(biāo)志物改變(PIK3CA、AKT1或PTEN)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌成年患者。數(shù)據(jù)顯示，2024年前三季度Capivasertib實(shí)現(xiàn)營(yíng)收2.7億美元，全年銷量有望超4億美元。

2. 來(lái)凱醫(yī)藥: 2024年5月，LAE002獲FD批準(zhǔn)III期臨床試驗(yàn)方案，聯(lián)合LAE001(CYP17A1/CYP11B2雙重抑制劑)，治療經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌(mCRPC)。

    2024年5月，LAE002在中國(guó)啟動(dòng)了III期關(guān)鍵臨床試驗(yàn)AFFIRM-205，聯(lián)合氟維司群，治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性HR+/HER2-乳腺癌，用于治療PIK3CA/AKT1/PTE改變的HR+/HER2-乳腺癌患者，目前項(xiàng)目進(jìn)展順利。

3.恒瑞醫(yī)藥和山東盛迪醫(yī)藥：2025年6月， HRS7415片獲得《藥物臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)通知書》，資料顯示，HRS7415片通過(guò)抑制AKT影響底物蛋白磷酸化，發(fā)揮抗腫瘤作用，累計(jì)研發(fā)費(fèi)用約5482萬(wàn)元。

4.正大天晴：的NTQ1062是一款A(yù)KT抑制劑，數(shù)據(jù)顯示，該產(chǎn)品于2021年5月頭次申報(bào)臨床，同年7月頭次獲批臨床，并于8月頭次登記啟動(dòng) I 期臨床針對(duì)實(shí)體瘤(登記號(hào)：CTR20211999)，目標(biāo)入組21人，已于2021年9月完成頭例受試者的入組工作。

默沙東的MK-2206、禮來(lái)的LY2780301、羅氏的Ipatasertib等均以失敗告終。

三、AKT抑制劑研發(fā)中常用的表型檢測(cè)指標(biāo)
在藥物發(fā)現(xiàn)和早期研發(fā)階段，為了評(píng)估AKT抑制劑的作用和有效性，會(huì)使用一系列表型檢測(cè)指標(biāo)。

1.下游信號(hào)分子磷酸化水平
檢測(cè) AKT 本身被抑制后的磷酸化 (例如 p-AKT Ser473 / Thr308) 水平變化。下游靶標(biāo) (substrates) 磷酸化，例如 GSK-3β、4E-BP1、S6K、mTOR 靶點(diǎn)等，這些都是經(jīng)典的 AKT-通路讀出指標(biāo)�？赏ㄟ^(guò) Western blot、ELISA 、TR-FRET或流式細(xì)胞等技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)抑制效果。

（1）THUNDER TR-FRET 磷酸化蛋白檢測(cè)
Phospho-AKT為例
THUNDER TR-FRET時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，僅需1~4h。一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技術(shù)，采用夾心法，檢測(cè)胞內(nèi)AKT磷酸化水平和總AKT水平。

圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測(cè)原理示意圖

用IGF-1處理MCF7細(xì)胞（60000個(gè)細(xì)胞/孔）室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，不同酶標(biāo)儀對(duì)信號(hào)的影響。用LY294002、Wortmannin和S961處理MCF7細(xì)胞（60000個(gè)/孔），在室溫下孵育30分鐘，然后用1µM胰島素刺激細(xì)胞，在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，LY294002和Wortmannin可以抑制AKT蛋白S473位點(diǎn)的磷酸化，而S961則無(wú)抑制效果。

圖. THUNDER Phospho-AKT (S473)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

Phospho-GSK3β (S9)為例
用Insulin處理MCF7細(xì)胞（75000個(gè)細(xì)胞/孔）與IGF-1在室溫下孵育30分鐘。EC50為9.6nM。抑制劑UCN-01實(shí)驗(yàn)中，用UCN-01室溫孵育MCF7細(xì)胞（75000個(gè)細(xì)胞/孔）2小時(shí)，再用Insulin孵育30分鐘，可以看到GSK3β在S9位點(diǎn)磷酸化被抑制。

圖. THUNDER Phospho- GSK3β（S9）驗(yàn)證數(shù)據(jù)

2. 細(xì)胞存活 / 凋亡指標(biāo)
（1）細(xì)胞存活率 (viability)：使用 MTT / CCK-8 / LDH/CTG 等試劑檢測(cè)細(xì)胞在給藥后的存活變化。（CTG：UA070103，MTT：abs50010，CCK-8：abs50003，LDH：abs580274）
（2）凋亡 (apoptosis)：通過(guò) Annexin V/PI 染色+流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry)，或 Caspase 活性 (例如caspase-3/7) 檢測(cè)來(lái)評(píng)估細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡。

UA-Glo® Caspase 3/7 Assay
即用型 Caspases 3/7細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒用于定量檢測(cè)細(xì)胞中 Caspases 3 和 7的活性。將該試劑加入待測(cè)細(xì)胞后，細(xì)胞裂解釋出的 Caspases 3/7切割試劑中的 Caspases 3/7特異性的多肽熒光素偶聯(lián)底物從而釋出熒光素，試劑中的熒光素酶可以催化熒光素反應(yīng)而產(chǎn)生光，光的強(qiáng)度和 Caspases 3/7的活性成正比關(guān)系。該試劑具有信噪比高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。均質(zhì)即用型的配方減少了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和操作步驟，降低了因?yàn)槎啻渭訕訉?dǎo)致的誤差，且其穩(wěn)定的輝光信號(hào)使該產(chǎn)品尤其適合高通量的化合物篩選。

圖：加入檢測(cè)試劑后30min-130min讀取熒光值的劑量曲線，表格為計(jì)算所得的EC50值。

Caspases3/7細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑檢測(cè)化合物Staurosporine(STSP)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的作用：4x10⁵/ml的HeLa細(xì)胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔。24小時(shí)后加入3倍稀釋的STSP，37℃ 5%CO2孵育6h后按照Caspases3/7細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑的說(shuō)明進(jìn)行Caspases3/7活性檢測(cè)。

（3）減少抗凋亡信號(hào) (如 Bcl-2, Bcl-xL) 或促進(jìn)促凋亡蛋白 (例如 Bad, Bax) 的激活/表達(dá)，也是用來(lái)驗(yàn)證藥物作用的指標(biāo)。

3．代謝指標(biāo)
AKT通路與細(xì)胞代謝 (如葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生) 有深度關(guān)聯(lián)�？蓽y(cè)量葡萄糖攝入 (使用放射性或熒光糖類似物)、乳酸分泌 (lactate assay)、線粒體功能 (如ATP水平、線粒體膜電位) 等。

4. 殺傷功能檢測(cè)
顆粒酶是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）表達(dá)的絲氨酸蛋白酶家族，它們通過(guò)胞吐作用在溶酶體樣顆粒中釋放。顆粒酶B（GRANZYME B）在所有顆粒酶中具有最強(qiáng)的凋亡活性。

THUNDER Biomarker檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的Granzyme B抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中Granzyme B 結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與Granzyme B濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬。

圖：THUNDER Granzyme B 檢測(cè)原理流程及標(biāo)曲

5. 生物標(biāo)志物檢測(cè)
以Human VEGF為例
THUNDER細(xì)胞因子檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的VEGF抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中VEGF結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與VEGF濃度成正比。全程僅需1.5h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬，檢測(cè)范圍：14-30,000pg/ml

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