G-418(遺傳霉素)的作用機(jī)理及在構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中的應(yīng)用

G-418（遺傳霉素，AbMole，M2719）一種在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物研究中常用且重要的工具分子，多用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的篩選、轉(zhuǎn)基因動植物研究等實(shí)驗(yàn)。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。
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一、G-418作用機(jī)理
G-418（遺傳霉素，AbMole，M2719）屬于氨基糖苷類化合物。G-418 主要作用機(jī)制是與核糖體進(jìn)行不可逆的結(jié)合。核糖體在細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成過程中承擔(dān)著核心角色，它負(fù)責(zé)將 mRNA 上的遺傳信息翻譯為蛋白質(zhì)。而 G-418 與核糖體結(jié)合后，會阻斷核糖體中的蛋白合成，導(dǎo)致翻譯過程提前終止或者發(fā)生錯(cuò)譯現(xiàn)象。在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者原核轉(zhuǎn)化中，實(shí)驗(yàn)人員可以選擇Neo基因（編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，APH）作為篩選標(biāo)記，與目的基因串聯(lián)一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化。以真核細(xì)胞為例，當(dāng)Neo被成功整合進(jìn)細(xì)胞 DNA 后，會啟動 Neo 基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄，生成相應(yīng)的 mRNA，進(jìn)而翻譯出氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。該酶能夠共價(jià)修飾 G-418，改變 G-418 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其無法與核糖體正常結(jié)合，從而削弱了 G-418 對細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制作用。成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞即可獲得對 G-418 的抗性。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
二、G-418用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選
在細(xì)胞生物學(xué)研究中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立是深入研究基因功能、信號通路等的重要手段。G-418（遺傳霉素，AbMole，M2719）通過其抗性篩選作用，可以幫助篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的陽性細(xì)胞株，這些細(xì)胞株在后續(xù)的細(xì)胞擴(kuò)增和制備過程中能夠保持其遺傳穩(wěn)定性。一般來說G-418的作用濃度在100-1000 μg/mL，但在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)先建立篩選曲線以明確最佳篩選濃度，即用培養(yǎng)基將G418稀釋成不同的濃度梯度，一般而言，能在10-14天內(nèi)殺死全部未轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的最低濃度即為最佳篩選濃度；另外需要注意的是篩選培養(yǎng)基不需要額外加入雙抗（鏈霉素、青霉素）。確定最佳篩選濃度后即可進(jìn)行篩選，一般在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)將細(xì)胞消化重新鋪板，在上述操作中需要控制細(xì)胞的密度，不要超過50%，待細(xì)胞再次鋪板完成后即可加入篩選培養(yǎng)基，注意每隔3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。

二、范例詳解
Aging Cell. 2021 Jan;20(1):e13282
上述文章主要研究了SPATA4在改善由衰老引起的代謝功能障礙中的作用。研究人員通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)SPATA4能夠促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化和脂肪組織擴(kuò)張，從而改善衰老誘導(dǎo)的代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)人員還使用3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，通過電穿孔技術(shù)將Spata4基因?qū)�入�?xì)胞，并使用AbMole的G-418（遺傳霉素，AbMole，M2719）篩選和維持過表達(dá)細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] Z. Li, K. Xu, S. Zhao, et al., SPATA4 improves aging-induced metabolic dysfunction through promotion of preadipocyte differentiation and adipose tissue expansion, Aging cell 20(1) (2021) e13282.