依據(jù)肌紅蛋白化學(xué)測量肉類顏色指南

肉類顏色測量指南
肌紅蛋白化學(xué)

A.肌紅蛋白的基本化學(xué)

肌紅蛋白是決定肉色的水溶性 蛋白質(zhì) 。 在其8個 α 螺旋（通常標(biāo)記為A-H）結(jié)構(gòu)中，含有中心鐵原子的輔酶血紅素基團位于蛋白質(zhì)的疏水核心區(qū)域。該鐵原子的六個配位鍵中，四個連接鐵原子與血紅素環(huán)，第五個與鄰近的組氨酸-93相連，第六個位點可逆結(jié)合配體,包括雙原子氧、一氧化碳、水和一氧化氮。第六配位位點的配體種類及鐵原子的價態(tài)，通過肌紅蛋白的四種化學(xué)形態(tài)——脫氧肌紅蛋白（DMb）、氧合肌紅蛋白（OMb）、羧化肌紅蛋白（COMb）和高鐵肌紅蛋白（MMb）——共同決定肉色變化，

具體可見圖2.1。

脫氧肌紅蛋白會使肉質(zhì)呈現(xiàn)深紫紅色或紫粉色，這種色澤特征常見于新鮮肉類及真空包裝制品的內(nèi)部。該物質(zhì)含有亞鐵離子（Fe2+），其第六配位位點處于空置狀態(tài)（未結(jié)合配體）。要維持脫氧肌紅蛋白（DMb）的形態(tài)，真空包裝或肌肉內(nèi)部需保持極低的氧分壓（<1.4毫米汞柱）。

當(dāng)氧氣與脫氧肌紅蛋白結(jié)合時，會形成亮紅色的氧合肌紅蛋白（OMb），其亞鐵離子的第六配位位點結(jié)合了雙原子氧（O₂）。氧配體還會與遠(yuǎn)端組氨酸-64相互作用，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比未結(jié)合配體的脫氧肌紅蛋白更為致密。當(dāng)一氧化碳結(jié)合到脫氧肌紅蛋白的空置第六位時，會形成穩(wěn)定的亮紅色羧基肌紅蛋白（CMb），此時環(huán)境需無氧。即使存在氧氣（濃度不同），羧基肌紅蛋白也會轉(zhuǎn)化為氧合肌紅蛋白（OMb）或金屬肌紅蛋白（MMb）。變性肌紅蛋白是肌紅蛋白的氧化產(chǎn)物，呈棕褐色至棕色，其含鐵離子為三價鐵（Fe3+）。

通常情況下，當(dāng)氧濃度較低（<7 mm Hg或約1-2%）時，MMb容易形成。水是MMb中鐵原子第6位的配體。DMb、OMb、COMb和MMb的數(shù)碼照片可在 AMSA 網(wǎng)站上查看。

B.肌紅蛋白氧化還原形式的相互轉(zhuǎn)化動力學(xué)

肌紅蛋白的氧合或開花（圖2.1中的反應(yīng)1）取決于時間、 溫度 、 pH 、 以及線粒體對氧氣的競爭。更具體地說，肌紅蛋白與線粒體之間對氧氣的競爭決定了氧氣滲透到肉品表面以下的程度，這顯著影響了表面顏色的強度.當(dāng)氧氣分壓高于大氣壓時，會促進肉品表面及緊鄰下方形成更厚的OMb層。在無氧條件下，DMb也會

圖2.1. 新鮮肉中肌紅蛋白氧化還原形式相互轉(zhuǎn)化的示意圖。
由堪薩斯州立大學(xué)M.C.亨特博士和猶他州立大學(xué)D.P.科恩福斯博士提供。

暴露于一氧化碳時，反應(yīng)5會呈現(xiàn)紅色；該反應(yīng)可逆，但正向反應(yīng)更易發(fā)生。

OMb向DMb的脫氧反應(yīng)（圖2.1中的反應(yīng)3）在低氧分壓條件下更易發(fā)生，這種情況通常出現(xiàn)在肌肉組織中的溶解氧被線粒體呼吸等各類反應(yīng)消耗時。當(dāng)氧氣重新與DMb結(jié)合時,可能立即引發(fā)二次開花現(xiàn)象。但DMb容易被氧自由基和活性氧（主要是過氧化氫）氧化,形成MMb（反應(yīng)3右上方的分支）。該反應(yīng)在氧分壓低于7毫米汞柱時反應(yīng)最快，因為此時氧氣濃度極低，無法與所有可用的DMb結(jié)合，導(dǎo)致DMb與過氧化氫反應(yīng)的量充足。

當(dāng)氧分壓高于7毫米汞柱時，氧氣與DMb結(jié)合的量增加，導(dǎo)致可用于與過氧化氫反應(yīng)的DMb減少。實際上，高濃度的OMb會抑制MMb的形成。從熱力學(xué)角度看，氧化甲基苯（OMb）不易被氧化為甲基甲基苯（MMb），因此反應(yīng)2發(fā)生的可能性較低。肉類中常見的快速褐變現(xiàn)象看似與這一化學(xué)過程相矛盾，但MMb的生成源于OMb的脫氧反應(yīng)，該反應(yīng)會迅速氧化為DMb，而DMb又能快速轉(zhuǎn)化為MMb。

在有氧條件下，金屬離子（如鐵、銅）會刺激雙原子氧形成氧自由基，從而引發(fā)MMb的生成。金屬螯合劑（如檸檬酸鹽、磷酸鹽等）可抑制或延緩MMb的形成。自由基清除抗氧化劑（如 TBHQ 、BHT、BHA、維生素E、香料提取物及植物多酚）同樣能有效減緩MMb的生成。

亞鐵DMb氧化為鐵MMb會引發(fā)褐色變色。 MMb的生成通常始于表層OMb與內(nèi)部DMb之間的界面處，此處 氧分壓不足以使所有可用DMb完全氧化。因此，部分DMb可與氧自由基反應(yīng)生成MMb。過氧化氫和氧自由基它們在有氧條件下持續(xù)存在，因為它們是線粒體代謝的副產(chǎn)物。隨著MMb濃度的增加，MMb的薄層會逐漸增厚。

隨著底層MMb帶逐漸增厚、侵入并取代OMb層，表面OMb層逐漸變薄，直至肉品表面顏色從鮮紅變?yōu)榘导t，最終呈褐色。延遲亞表層MMb出現(xiàn)的條件包括低溫、高pH值、抗氧化能力以及更強的還原活性。 MMb還原通過再生亞鐵肌紅蛋白來影響肉品色澤穩(wěn)定性。 然而，這種反應(yīng) 依賴于氧清除能力、還原酶和NADH池，這些在死后肌肉中都是有限且持續(xù)消耗的。通過肉品內(nèi)源性還原系統(tǒng)進行MMb還原，可能為減少MMb形成和延長鮮肉色澤保質(zhì)期提供關(guān)鍵策略。

酶促與非酶促反應(yīng)均可將MMb還原為DMb（反應(yīng)4），這一過程對肉品色澤穩(wěn)定性至關(guān)重要。雖然影響該反應(yīng)的因素眾多，但氧氣消耗量、MMb還原活性（MRA 值）以及死后積累的NADH儲備，是決定肉品色澤 穩(wěn)定期的關(guān)鍵變量。研究表明，添加丙酮酸、乳酸、蘋果酸等糖酵解和三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，能有效再生還原當(dāng)量，從而延長肉品色澤穩(wěn)定性。

c. 肉色視覺與實際顏料化學(xué)的實踐對比

在肉類加工行業(yè)中，肉色化學(xué)變化常令人困惑，因為肉色變化的肉眼觀察結(jié)果與第IIB節(jié)所述的化學(xué)反應(yīng)路徑存在差異。從事肉類及肉制品研究的行業(yè)從業(yè)者和肉品科學(xué)家通常會觀察到，暗紅色的OMb直接轉(zhuǎn)化為 棕色的MMb。因此，圖2.1所示的原理有時難以實際應(yīng)用，尤其是在排查肉色異常問題時。特別值得注意的是，圖2.1顯示紫色的DMb是OMb轉(zhuǎn)化為MMb的中間產(chǎn)物，但在實際操作中很少觀察到這一過程。相反，圖2.2中的反應(yīng)2a表明，暗紅色的OMb會直接轉(zhuǎn)化為 棕色的MMb，整個過程無需經(jīng)過紫色DMb的中間階段。

1. 化學(xué)反應(yīng)路徑與視覺感知路徑之間看似矛盾的現(xiàn)象該如何解釋？ 答案在于仔細(xì)觀察肉品表面及深層組織的變化。新鮮切割的肉品表面呈現(xiàn)紫色（DMb），這是由于缺氧所致。

當(dāng)肉品在空氣中放置數(shù)分鐘后，其表面會變成鮮紅色（OMb，圖2.2中的反應(yīng)1）。若對肉品進行橫截面觀察，會發(fā)現(xiàn)紅色表層厚度約為 <1毫米，而深層肌肉組織仍保持紫色。經(jīng)過數(shù)小時后，紅色表層通常會增厚至2-3毫米（低耗氧肌肉組織增厚更明顯，高耗氧肌肉組織增厚程度較輕）。當(dāng)肉品在空氣中放置1至3天后，當(dāng)溫度降至2-4°C時，OMb層下方會清晰可見一條細(xì)長的棕色MMb條帶。

如前所述，這條棕色條帶的形成源于DMb與氧自由基反應(yīng)生成MMb。由于MMb的生成速度通�？煊谀娣磻�(yīng)2b（圖2.1中的反應(yīng)3），即MMb向DMb的轉(zhuǎn)化，因此MMb濃度會隨時間推移逐漸升高。經(jīng)過數(shù)天的儲存或展示后，隨著MMb層不斷向表面遷移，OMb表面層的厚度逐漸減小，導(dǎo)致OMb層顯得暗淡無光。最終OMb層的 MRA 值耗盡，MMb層完全暴露于表面，引發(fā)整體變色現(xiàn)象。

2. 為何能確定DMb是褐變反應(yīng)中的中間產(chǎn)物？與空氣中21%的氧含量相比，70-80%氧含量的環(huán)境中肌紅蛋白的形成速度顯著減緩。因此，OMb無法與氧自由基反應(yīng)生成MMb。此外，由于存在動態(tài)解離平衡，OMb會持續(xù)與氧自由基結(jié)合形成DMb，同時也會分解為OMb。在氧含量較低的褐變MMb條帶中，部分DMb會重新與氧自由基結(jié)合而非氧氣，從而導(dǎo)致DMb快速氧化為MMb。

3. 當(dāng)DMb形成時，為何表面顏色會直接從紅色變?yōu)樽厣�，而不會出現(xiàn)紫色中間過渡？這一現(xiàn)象的奧秘在于：在儲存或展示的最初1至3天內(nèi)，覆蓋其上的紅色OMb層會遮蔽紫色DMb的形成； 隨著MMb層厚度逐漸增加，這種遮蔽作用也會減弱。此外，由于表面區(qū)域氧氣濃度較高，原本通過平衡解離形成的少量DMb會在OMb表層迅速轉(zhuǎn)化為OMb。

4. 真空（厭氧）儲存足夠時間后，肌肉中MMb如何轉(zhuǎn)化為紫色DMb？首先，由于真空處理導(dǎo)致部分氧氣被移除（但未完全清除），此時會形成細(xì)密的棕色MMb條帶。正如前文所述，肉表面低氧環(huán)境有利于褐變反應(yīng)發(fā)生。紫色DMb的顯現(xiàn)需待表層紅色OMb和棕色MMb完全消失后才會顯現(xiàn)。氧合肌紅蛋白水平歸零主要歸因于肌肉線粒體的耗氧作用，而MMb水平歸零則源于其緩慢的酶促或非酶促還原過程。眾所周知，顏色穩(wěn)定的肌肉比顏色不穩(wěn)定的肌肉更容易完成這一轉(zhuǎn)化——后者可能僅部分將MMb轉(zhuǎn)化為DMb。

不同代謝產(chǎn)物（OMb）的保存溫度或氧化代謝產(chǎn)物（DMb）的生成溫度存在差異，因此對儲存溫度的建議也各不相同。例如，氧化代謝產(chǎn)物在 低溫環(huán)境（-1至2°C）下最為穩(wěn)定。但若真空包裝肉類在較高溫度（3至4°C或更高）下存放數(shù)小時，氧化代謝產(chǎn)物與還原代謝產(chǎn)物的界面區(qū)域會加速形成DMb，這會刺激線粒體耗氧作用，進而引發(fā)圖2.2中2a和2b所示的還原代謝產(chǎn)物還原反應(yīng)。

采用改良?xì)怏w環(huán)境進行有氧包裝的肉類同樣會變褐，但變褐速度因肌肉類型、胴體死亡時間（尤其是溫度較高時）及其他零售展示條件而異。細(xì)菌生長還可能影響反應(yīng)2b和3。反應(yīng)3和4按前一節(jié)所述進行。

5. 為何要通過兩個新出現(xiàn)的彩色三角形來混淆問題？實際操作中，將圖2.2所示的OMb轉(zhuǎn)化為DMb的視覺轉(zhuǎn)換過程，與中間產(chǎn)物MMb的生成環(huán)節(jié)分開處理，能讓行業(yè)更輕松地管理色彩問題。這種分步處理方式將所需化學(xué)反應(yīng)分解為兩個關(guān)鍵且實用的步驟：MMb生成（2a）總能順利進行，而MMb還原（2b）則常遇到難題，需要特別注意加工工藝的細(xì)節(jié)。

D.影響肉色的因素

文獻明確記載，肉色受多種因素影響。外在因素包括動物遺傳、性別、年齡、飼料能量密度、飼養(yǎng)時長、季節(jié)性、屠宰前應(yīng)激、胴體重，以及多種屠宰后處理條件（固定方式、影響冷卻速率的冷卻參數(shù)、胴體間距與排列、燙毛與唱音處理、胴體電刺激標(biāo)準(zhǔn)及抗菌干預(yù)措施），以及屠宰后處理。

圖2.2. 肌紅蛋白氧化還原的視覺與實際相互轉(zhuǎn)化示意圖
新鮮肉類中的形態(tài)。由堪薩斯州立大學(xué)M. C. Hunt提供。

加工和包裝方法、儲存時間和溫度、暴露于氧氣的程度以及肉類經(jīng)歷的顏色周期次數(shù)，尤其是產(chǎn)品死后產(chǎn)品的年齡通常通過影響肉色的內(nèi)在因素來影響肉色。例如，許多外在因素可以影響死后pH下降的速度和程度、肌肉轉(zhuǎn)化為肉時蛋白質(zhì)變性的量、肉中抗氧化劑的濃度、可用于調(diào)節(jié)肉色的生化中間體以及不飽和脂肪酸的數(shù)量。內(nèi)在因素如pH、肌肉類型、肌肉內(nèi)的區(qū)域、肌纖維組成、肌紅蛋白濃度、與肉色化學(xué)相關(guān)的各種亞細(xì)胞成分的破壞、持水能力、微生物負(fù)荷和溫度歷史對兩個關(guān)鍵因素影響極大，即肉對氧氣的利用和肉降低MMb的能力。在設(shè)計和報告肉色研究時，應(yīng)盡可能考慮這些因素。

e. 肌肉代謝和肉色

胴體肌肉的細(xì)胞生化特性存在差異，這直接影響骨骼肌的死后代謝過程。牛肉肌肉來源對鮮肉色澤及熟肉色澤的影響已被廣泛研究。麥肯納團隊（2005）通過分析19種牛肉肌肉的多種生化機制，揭示了色澤穩(wěn)定性的影響因素；而曼奇尼等學(xué)者（2009）和 蘇曼團隊（2009）則發(fā)現(xiàn)，色澤穩(wěn)定型與易變型 的牛肉肌肉對MAP系統(tǒng)及烹飪過程中褐變反應(yīng)存在顯著差異。

線粒體在肉色形成中的作用備受關(guān)注，其影響肌紅蛋白氧化還原穩(wěn)定性的機制也已得到深入研究。維生素E（唐等，2005a）和脂質(zhì)氧化（唐等，2005年研究顯示，氧氣消耗率（唐等人，2005b；莫漢等人，2010c）和代謝物（唐等人，2005c；拉馬納坦等人，2009；莫漢等人，2010b）在研究線粒體與肌紅蛋白的相互作用時表明，外膜中的電子傳遞鏈和還原酶能夠還原MMb，因此參與維持顏色穩(wěn)定性。因此，從肌肉組織中分離出完整且功能正常的線粒體，是這類實驗成功的關(guān)鍵。

F. 熟肉顏色

烹飪過程中，肌紅蛋白會發(fā)生變性，這正是熟肉制品呈現(xiàn)典型暗褐色的關(guān)鍵原因。但不同氧化還原態(tài)的肌紅蛋白變性溫度并不固定，因此熟食內(nèi)部的相對棕褐色并不一定意味著牛肉已達到安全標(biāo)準(zhǔn)（需達到160華氏度或71攝氏度并持續(xù)1秒，或采用其他經(jīng)過驗證的溫度-時間組合）。肌紅蛋白 的變性溫度取決于其氧化還原狀態(tài)。具體而言，肌紅蛋白對熱誘導(dǎo)變性的相對抗性依次為：COMb > DMb > OMb > MMb（Ballard，2004）。

牛肉過早褐變是指在烹飪過程中，當(dāng)溫度過低導(dǎo)致病原體無法滅活時，肌紅蛋白發(fā)生變性并呈現(xiàn)熟成外觀的現(xiàn)象。Killinger等人（2000年）的研究顯示，從本地零售店購買的絞肉中，約47%存在過早褐變問題。 影響牛肉易褐變的因素 既包括內(nèi)在因素（如肌紅蛋白氧化還原狀態(tài)、肌肉來源及抗氧化劑含量），也涉及外在因素（如包裝方式、儲存條件以及冷凍狀態(tài)下的烹飪方式）。

肌紅蛋白還可能導(dǎo)致持續(xù)粉紅色（與過早褐變相反），這種情況下的色素相對穩(wěn)定，難以通過加熱變性 。持續(xù)粉紅色和達到典型熟度所需的終點溫度變化（即需要更多烹飪時間才能達到中等生熟度） 都?xì)w因于 羧基肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性（≈<|pH> 5 . 6）。

G. 熟肉顏色

亞硝酸鹽添加（圖2.3）會賦予熟成肉制品特有的粉紅色澤。添加的亞硝酸鹽與DMb的血紅素基團結(jié)合后，會迅速被還原為一氧化氮（NO），同時血紅素也會氧化為三價鐵形式（圖2.3）。這種反應(yīng)的直觀表現(xiàn)是：當(dāng)含亞硝酸鹽的腌料加入新鮮肉類時，肉質(zhì)會迅速褐變。在無氧條件下，褐變的一氧化氮-甲基肉堿（NO-MMb）會被外源還原劑（如赤蘚酸鹽）快速還原為紅色的一氧化氮-甲基肉堿（NO-Mb），或通過內(nèi)源性還原劑與MMb還原酶的協(xié)同作用緩慢還原。部分研究表明，在含亞硝酸鹽和還原劑的腌料中，亞硝酸鹽還會與還原劑快速反應(yīng)生成NO，進而與MMb結(jié)合形成NO-MMb。

處理含亞硝酸鹽和赤蘚酸鹽的鹽水時，需注意將溫度控制在10°C以下。若溫度過高，赤蘚酸鹽會快速將亞硝酸鹽還原為一氧化氮氣體，導(dǎo)致鹽水在注入前逸散，最終造成成品色澤固化效果不佳甚至完全無法顯現(xiàn)。

在烹飪或發(fā)酵過程中，一氧化氮會使肌紅蛋白和血紅蛋白發(fā)生變性，暴露其中心位置的卟啉環(huán)，由于亞鐵與一氧化氮的相互作用，導(dǎo)致肉變色（一氧化氮血紅素），粉紅色在光照和氧氣作用下會逐漸褪為灰色。
 

圖2.3. 一氧化氮血紅素形成的反應(yīng)。注：實心箭頭表示反應(yīng)，虛線箭頭表示有利于反應(yīng)的條件。“+”表示兩個相連的“反應(yīng)物”之間的反應(yīng)，產(chǎn)物由下一個箭頭表示。

例如：
• 肌紅蛋白+NaNO 可以形成MMb（這是某些 MRA 檢測中的一個步驟）。
• 肌紅蛋白與一氧化氮結(jié)合可形成NO-MMb。
• 肌紅蛋白與一氧化氮可結(jié)合形成NO-Mb，或在厭氧條件下，NO-MMb可被還原為NO-Mb。
• 高溫或酸性環(huán)境會促使球蛋白發(fā)生變性，此時脫鐵血紅蛋白（NO-Mb）將轉(zhuǎn)化為一氧化氮血紅素。

由堪薩斯州立大學(xué)M.C.亨特博士和猶他州立大學(xué)D.P.康福斯博士提供

1. 真正的腌制（亞硝化）劑究竟是亞硝酸鹽還是NO？ 不同文獻對此存在爭議。最新研究表明，亞硝酸鹽（NO₂⁻⁻）是與血紅素鐵最先發(fā)生反應(yīng)的化合物。這一結(jié)論合乎邏輯：亞硝酸鹽具有水溶性，分子直徑足夠小可滲透血紅素裂隙，其負(fù)電荷還能通過靜電作用吸引帶正電的血紅素鐵。相比之下，NO氣體水溶性較差，容易從鹽水中逸出。部分針對純肌紅蛋白溶液或肉餡面糊的研究顯示，接觸NO氣體后會出現(xiàn)腌制色澤變化。

但需注意，這些實驗中NO可能并未直接與血紅素鐵發(fā)生反應(yīng)。已知在有氧條件下，NO會與氧氣反應(yīng)生成二氧化氮（NO ₂），后者又會迅速與水反應(yīng)形成亞硝酸根離子。因此，即便存在NO氣體，亞硝酸鹽仍可能是肉類腌制過程中的主要作用成分。歷史上，硝酸鹽曾被用于肉類腌制，但硝酸鹽需經(jīng)細(xì)菌作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽才能實現(xiàn)腌制效果。烤制或熏制的肉類也可能因二氧化氮的存在而產(chǎn)生腌制色澤，當(dāng)濕潤表面接觸燃燒氣體時，會形成亞硝酸根離子。

2. 熟肉色素是單硝基血紅素還是二硝基血紅素？歷史化學(xué)研究表明，形成該色素需要2摩爾亞硝酸鹽。1摩爾熟肉色素表明該色素為二硝基血紅素。然而，唯一一項采用質(zhì)譜分析熟色素結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其分子離子碎片的原子質(zhì)量為646單位，而非二硝基血紅素預(yù)測的676原子質(zhì)量單位。這一結(jié)果強烈表明腌制肉的色素是單硝基血紅素。進一步研究發(fā)現(xiàn)，另一種一氧化氮（NO）與該色素的球蛋白部分結(jié)合。因此，肌紅蛋白結(jié)合了2摩爾的一氧化氮，而誘導(dǎo)顏色的血紅素基團僅結(jié)合了1摩爾的一氧化氮。

H. 金屬光澤

虹彩效應(yīng)會在熟食表面形成絢麗的彩虹狀光澤。這種萬花筒般的視覺效果通常呈現(xiàn)綠、紅、橙、黃等色彩，其成因在于產(chǎn)品表面微觀結(jié)構(gòu)與光線衍射的相互作用，而非肌紅蛋白的氧化還原狀態(tài)。具體來說，肉類表面結(jié)構(gòu)均勻時會產(chǎn)生有利于虹彩形成的光線衍射，而表面微觀結(jié)構(gòu)的紊亂則會使光線以 相對不規(guī)則的方式反射，從而抑制虹彩效應(yīng)的顯現(xiàn)（Lawrence等，2002a，b）。